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标题:[讨论帖]TCC的人脐静脉内皮细胞株CRL-1730不能表达ACE

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[讨论帖]TCC的人脐静脉内皮细胞株CRL-1730不能表达ACE



我因为要做一些关于血管紧张素转换酶I及II的一些研究,在培养原代HUVEc的过程中遇到一些困难,后来转做细胞株,因为实验室有CRL-1730,所以就直接用了,没有联系EA。hy926及其他的细胞株,但是在做的过程中发现使用RT-PCR的方法来验证mRNA表达时,管家基因跑的很好,但总是不能够跑出目的条带来。换了3条引物,包括文献上的成熟引物都不行。后来觉得问题大了,于是到处查文献,发现国内外目前使用CRL-1730来做实验的本来都很少,而且做NOS的有circulation上的几篇,做VEGF的也不少,唯独没有做ACE研究的。但是因为文献检索水平限制,目前又没有找到一篇文献专门报道说CRL-1730不表达ACE及ACE2.但是做EA.HY926的有明确的报道ACE及ACE2的表达,其次就是ECV-304了,因为这个东西目前争议很大,所以没有采用。因此我对此表示深深的怀疑,那就是这个1730细胞株根本就不能表达ACE。ACE是膜蛋白,因此我想先通过ELISA或其他方法验证一下是否有其存在,如果这些方法都不能证实其存在,那就证实了我的猜测,不知道哪位高人在这方面有真知灼见,指点一下小弟。
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请大侠救我啊,我找到一篇文献,居然用CRL-1730作为对照组细胞来验证是否有ACE表达,真是荒谬,其理论基础是在细胞损伤时候vwf和ACE同时增加,结果认为只要vwf增加,ACE 必定增加。附文献,请高手阅读后考验我的观点。
以下是细胞损伤时候vwf和ACE同时增加的来源,附件为以CRL-1730对照的文献
Angiotensin converting enzyme: an in vivo and in vitro marker of endothelial injury.

Matucci-Cerinic M, Jaffa A, Kahaleh B.

Institute of Internal Medicine IV, University of Florence, Italy.

An elevated level of von Willebrand factor (vWf) is a well-established marker for both in vivo and in vitro endothelial cell injury. Recent studies indicate that the plasma level of angiotensin-converting enzyme (ACE) in systemic sclerosis is reduced in association with elevated vWf levels. Because the endothelial cell is capable of producing both mediators, and because endothelial cell injury is a fundamental process in systemic sclerosis, we investigated in this study the effect of in vitro endothelial cell injury on the synthesis of both factors. Endothelial cells derived from human umbilical veins, in the second passage, were activated by exposure to interleukin-1 or lymphotoxin or were injured by radiation, actinomycin, or trypsin (each can be shown to induce dose-dependent endothelial cell cytotoxicity). ACE (spectrophotometric method) and vWf levels (enzyme-linked immunosorbent assay method) were determined in the supernatant and in the cell lysate 48 hours after cellular injury and activation. An increase in vWf levels was found in the lysate and in the supernatant from the cells that underwent injury or activation, whereas ACE levels were increased after activation but decreased after injury. Next, and as an in vivo clinical corollary to the in vitro endothelial cell injury, we evaluated ACE and vWf levels in the plasma of seven children in the acute phase of Kawasaki disease, a disorder characterized by widespread vascular injury. Plasma ACE levels were significantly lower than control levels, whereas vWf levels were increased, reflecting the known prominent endothelial cell injury in this disease.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)
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谢谢大家的帮助,我已经向ATCC官方网站及上述文章的作者发了E-mail.应该在下周有回复,ATCC讲他们将向细胞的提供者联系,了解这个细胞的生物学的详细信息。谢谢大家,我希望能够得到他们的满意答复,也和大家分享,有兄弟建议做个免疫组化来验证ACE的存在,这的却是个好主意,我再仔细看看,这个酶的分布主要在细胞膜,免疫组化应该可以鉴定。
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我想向你请教下关于CRL-1730的一些问题,这个细胞和原代的细胞有很大区别,不知道它是否具有原代细胞的一些功能,比如表达血管紧张素转换酶I及血管紧张素转换酶II,目前我查到的文献里面只有非常少的文章采用这个细胞株做实验,不知道到底是为什么呢?而且已经发表的文章里面用这个细胞株做NOS及VEGF的有,做ACE及ACEII的没有,甚至有文献讲这个细胞VIII的表达非常少,因此很是怀疑这个细胞到底是不是内皮细胞啊,到底能不能拿来实验呢,我重点想了解它能否表达ACE及ACE2,切盼您的回复!!

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对于CRL-1730这个细胞我也知之甚少,如果说这个细胞的原代细胞表达你说的几个酶,那么在这个细胞株的细胞里面也极有可能会表达,至于文献很少用到这个细胞株其原因我也不是很清楚,有可能是你文献没有查全。有一点肯定可以确定,你上ATCC就可以查到这个细胞是哪个器官来源的,就能明确是不是内皮细胞了,要确定它是否表达ACE及ACEII也很简单,做个最简单的免疫组化就ok了
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首先对楼主这种态度表示强烈的支持。
说几点自己的意见:首先RT-PCR这种实验方法是个半定量的东西,它的成功与否与引物有着很大的关系,两三次没有扩出目的基因也很正常,我曾经扩一个基因换了5个引物。CRL-1730这个细胞株我没有接触过,不知道你们实验室传了多少代了,我的意思是说可能是不是你们这个细胞株的特性等等有变化?ACE这个东西在体内算是一个高表达还是一个低表达?如果本来就低表达,你扩不出来目的基因也很正常吧。多试一试,ATCC的可信度还是比较高的。
PS:非常佩服楼主这种科研精神。
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向各位关注的战友通告一下,老外的回信一直没有等到,ATCC还在放假,不过我的RT已经跑出目的条带了,三条引物都有带,让人不好想;我扩大文献查找的范围,仍然所获不多。现在正跑WB验证蛋白表达的存在,有可能存在MRNA 表达而蛋白不表达的情况吗,可能会有吗?继续等待。。。。。。
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补充一下:目前ATCC官方网站一共有四种人脐静脉内皮细胞,CRL-1730(HUV-EC-C);CRL-2480(HUVEC-12);CRL-2873(HUVEC-CS);CRL-2922(EA.hy926);国内见的比较多的是第1种CRL-1730(HUV-EC-C);和第四种CRL-2922(EA.hy926)。根据目前我所查到的文献资料1730目前用来研究NO途径及VEGF受体及其表达的文章最多,其次是研究发现它缺乏雌激素受体,ET-1等表达目前的文献不详细,其官方说明的用途是转染宿主,表达产物是血管因子VIII。因此用这个细胞做试验的却让人很头疼啊。CRL-2922(EA.hy926)是个杂合的细胞,由肺癌细胞A549和人脐静脉内皮细胞原代杂合而成,具有内皮细胞的大部分特点,如脂质代谢、血管成形、血管活性因子表达等等,炎性因子释放和调整这些试验应该都可以考虑,但是已经有网友告诉我他们做TNF-a受体的试验遇到困难而改做原代培养的经历,因此也很难判断。而其就我目前所致的材料,HUVEC表达血管紧张素转换酶有许多条件:细胞因子VEGF可以刺激其表达,佛波酯(PMA)刺激其表达,细胞融合的程度越好,表达越多;原代传代越多,表达越少,到第17代的时候只有原代的30%,再多不知道了;ACEI可以刺激其mRNA表达增加及蛋白增加,但是对其反应活性是抑制的。因此希望使用内皮细胞株的战友们能多上来发表下意见,能让后来的战友少走弯路。请大家伸出援助之手,谢谢啦!!!!
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ECV304我觉得还是要说一下,这个细胞争议很大,但是我从文献检索的角度来看,国内外仍然有很多人使用,而其也明说他是血管内皮细胞。文献报道的情况来看这个VIII表达阴性的细胞,能够表达几乎所有的血管活性因子,研究凝血因子、血管成形、脂质代谢、高压力培养、流体力培养的文章很多,即使最近3年也有许多英文文章见刊,其中不乏高IF的文章,有文献将它和膀胱癌的细胞株T24做了仔细的对比,发现这两个细胞还是很多不同,304更多具有内皮细胞的特性。因此对于这个细胞株还想请大家多给点意见。谢谢大家
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我每次要做一个新的实验,都先上来园子四处看看,把旧帖仔细看一遍,重要的拿本子和笔记下来,反复琢磨,然后才操作,可以提前知道哪些重点,操作要点,谢谢园子的各位战友啦,感谢版主!!
ATCC和作者那边都没有消息,不过现在通过自己的努力验证了结果,继续实验。!!
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补充一下:目前ATCC官方网站一共有四种人脐静脉内皮细胞,CRL-1730(HUV-EC-C);CRL-2480(HUVEC-12);CRL-2873(HUVEC-CS);CRL-2922(EA.hy926);国内见的比较多的是第1种CRL-1730(HUV-EC-C);和第四种CRL-2922(EA.hy926)。

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您好,我想请教ATCC上有HUVEC-12吗,我查过,但没有找到。
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