细胞世界

1，这种方法可以，但此法出来的峰CV值较高，不是很好看。
2，必须，不用的话，Rnase无法通透。你看到有不用的，固定方法应该有所不同。

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谢谢你的回复

1. 4％多聚甲醛固定后，能保存几天？ 4℃还是-20℃？
2. 同样是预冷70％乙醇，我看有些用了triton有些没用

建议用70%的乙醇固定，无需打孔。

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我转染荧光标记的siRNA，文献报道用乙醇固定怕有泄漏

那你用Triton-X 100后，PI染料能够进入细胞内，此时难道就不会造成你的荧光标记的siRNA泄漏吗？

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这也是我心中的一个疑问，请问怎么解决？

PI染色上机检测一般不需要对照。
你的实验对照中需转染对照siRNA的PI染色就可以了。

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我想做有荧光的 和染PI的两个峰的检测，只有“转染对照siRNA的PI染色”就可以了吗

谢谢

不需要考虑这个问题，这个应该不会影响对你实验结果。
你转染siRNA应该是为了沉默某个基因的表达，而这个过程在你标记PI前应该已经完成了，标记PI时对于这个沉默的过程不会产生影响。
你转染的siRNA同时带有FAM应该是为了区别转染成功和未转染成功的细胞，标记PI时，FAM-siRNA可能有泄漏的机会，我想总不会是所有的都从细胞中出来吧，应该是少数的会出来，对于结果影响不大，如果你担心的话，我想可以在标记PI时往样品中再加一些FAM-siRNA，提高细胞外FAM-siRNA的浓度，这样如果FAM-siRNA能从细胞内出来，出来的也会少很多吧。呵呵，只是个人的一点建议。可以做预实验试试。

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乙醇固定，会导致大部分泄露。所以一般采用多聚甲醛固定，然后triton通透。

FAM是否阳性是为了判断siRNA是否转染成功。你的实验组数据应该是转染FAM-特异siRNA样品中FAM阳性的细胞的PI染色结果。而你的对照组数据应该是转染FAM-对照siRNA样品中FAM阳性的细胞的PI染色结果。不知道我有没有说明白。

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以前在看流式专贴的时候，有个战友提出GFP的流式检测问题，如下：


本人也是初次接触流式，此专区对本人真是受益菲浅。目前有些具体问题需要Schoman, Kassen,TCR等高人指点，先谢了！

1，本人将EGFP融合目的基因转入细胞内（该目的基因表达细胞核中），观察目的基因对细胞周期的影响。以GFP阳性细胞设门，检测该群细胞的DNA含量。看到该专区有些关于GFP设门的贴子，但具体如何设？请各位大侠能否解答的具体些。
2，我用了三个Control, 未转质粒也未染PI（Control 1），未转质粒染PI（Control 2），转质粒未染PI（Control 3），是否就是用Control 1调电压，而用Control 2和Control 3调节补偿？Control 1调到左下象限，Control 2在左上象限，Control 3则在右下象限，我觉得Control 3应该有两个细胞群（不可能有100%的转染效率），GFP阴性和阳性细胞群，但我的实验只有一个细胞群（荧光显微镜观察转染效率还是比较高的）。通过以上设置后检测我的样本，几乎100%细胞在右上象限（双阳性区），结果难以相信。
3，如果检测GFP阳性细胞的DNA含量是否就是指右上象限内的细胞的DNA含量？
4，GFP和PI分别用哪个通量，我们实验室是BD机子？

得到的回答是：
GFP用FL1，PI用FL2。
转基因阳性率高，所以你的细胞都在双阳性区是对的。
你应该分析转基因前和后的细胞周期的变化；以及转空载体（或者单纯GFP）的周期。

所以我要检测FAM和PI，是否也要那样做呢？