细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]转染后细胞都死了是怎么回事啊？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 16  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]转染后细胞都死了是怎么回事啊？

我佛慈悲[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74054
精华 0
积分 188
帖子 135
信誉分 100
可用分 1401
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
1

发表于 2012-4-5 12:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]转染后细胞都死了是怎么回事啊？



昨天做了一次转染，用的是英俊的脂质体2000转染试剂（刚买不到3个月），转染成纤维细胞（通过原代分离培养的，但是不是很纯有其他细胞），6孔板细胞量，转EGFP质粒（质粒没有问题，因为在别的细胞转染试过好用），按照说明书的比例质粒加4微克，转染试剂加10微升，转染复合物共500微升，孵育20分钟后，加到用PBS清洗两遍的6孔板中，补加500微升无血清和双抗的DMEM培养基，37°二氧化碳培养箱培养，5小时换液时发现：
许多细胞出现严重的凋亡现象，细胞呈扁平放射状，放射的突出有分叉，像树枝一样，看样子像是死了！
不知道细胞还能不能活过来，所以5小时换液换成含血清不含双抗的DMEM培养基过夜培养，结果今天早上发现细胞全死了！太伤心了！
以前也做过这种转染，有时也会出现细胞死的很严重的现象，有时就很好，曾经尝试在4-6小时转染的过程中加少量的血清，但作用好像不大!
是不是我的细胞有问题呢？请各位高手帮我分析一下原因呗谢谢了！
顶部
66+77[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75637
精华 1
积分 596
帖子 785
信誉分 103
可用分 4751
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
2

发表于 2012-4-5 12:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能细胞有差异吧，我也用lip2000转染的，5小时以后换不含抗生素的DMEM，细胞状态很好，元代细胞比较娇嫩
顶部
66+77[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75637
精华 1
积分 596
帖子 785
信誉分 103
可用分 4751
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
3

发表于 2012-4-5 12:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #2 66+77 的帖子

你用的也是lip2000的比例转染的吗？我想问下转染细胞效率怎么样呢？我以前转染成功过，但是效率不是很高！谢谢！
顶部
xueyouzhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76770
精华 0
积分 470
帖子 640
信誉分 100
可用分 3996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
4

发表于 2012-4-5 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用第三代的成纤维细胞转染，也遇到同样的问题，还没找到原因。请大家帮忙分析分析，谢谢拉
顶部
ROSE李[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76171
精华 0
积分 466
帖子 611
信誉分 100
可用分 3866
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
5

发表于 2012-4-5 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像lipo的说明书中不建议使用含抗生素的培养液。
顶部
ROSE李[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76171
精华 0
积分 466
帖子 611
信誉分 100
可用分 3866
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2012-4-5 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

专门找了一下，是不能用含抗生素的培养液，会导致细胞死亡。我现在是连正常培养的细胞都没有加，注意无菌操作就行了。要求转染过程中无血清、无抗生素。


查看积分策略说明
附件
2012-4-5 12:28
24654689.snap.jpg (33.41 KB)
 
顶部
kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
7

发表于 2012-4-5 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道转入的基因是否会引起细胞调亡。
另外建议降低lipfectamin的浓度试试看，我们研究室很多人都不用说明书推荐的用量的，经常是推荐用量的1／4。
用量高，细胞毒性也高，细胞容易死。我也遇到过此类情况，用量改为1／4就ok啦。
抗生素我们倒是不太在意，转染的时候不加，但是5个小时换液后培养一直都加的，没啥关系。
顶部
kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
8

发表于 2012-4-5 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我转过的成纤维细胞是3T3，不知道是不是我的目的基因问题，用说明书用量细胞会死，但是用1／4的话完全顺利进行。
还有转染时的细胞密度不要太低，否则会引起细胞死亡。
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
9

发表于 2012-4-5 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

兄弟，在转染之前最好是用无抗生素的培养基培养12小时，然后再进行转染。
顶部
我佛慈悲[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74054
精华 0
积分 188
帖子 135
信誉分 100
可用分 1401
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-4
状态 离线
10

发表于 2012-4-5 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家的回答，在此十分感谢！
我看到有的帖子说原代的细胞对血清很敏感，是不是转染过程中（尤其是4-6小时）会造成细胞死亡呢！我以前用过PK15细胞做转染对照试验，一个在4-6小时转染过程中加血清，一个不加，结果发现细胞都很好，而且转染效率也没有差别，至少证明在这种细胞中加不加血清不会影响转染效率，但对于原代的成纤维细胞，我就不知道应不应该在转染过程中加血清了！
顶部
 16  1/2 12››