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标题:[讨论帖]外源因子干预前及过程中是否需要改变血清浓度

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-4-5 14:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[讨论帖]外源因子干预前及过程中是否需要改变血清浓度



做细胞培养，绝大部分人可能会碰到外源因子干预细胞的过程。那么干预前及干预过程中血清浓度是否要改变呢？希望大家一起讨论一下。


发帖格式：

1.不同时段的血清浓度变化：
A:细胞株
B:干预前n小时（血清浓度）：。。。。。。
C:干预过程n小时（血清浓度）：。。。。。。
D：总干预时间？

2.你的理由：
A: 。。。。。。
B: 。。。。。。
C: 。。。。。。
D: 。。。。。。

我起个头说一下我的理解：

1.不同时段的血清浓度变化：

A:细胞株：293T 、Hela
B:干预前n小时（血清浓度）：正常培养，10％
C:干预过程n小时（血清浓度）：正常培养，10％
D：总干预时间？2－12h

2.我的理由：
A: 之所以不改变血清，因为正常培养更能接近生理状况，还有就是有些细胞如293T细胞本身贴壁不紧，晃动一下都可能飘起来，如果反复换液改变血清浓度，则可能导致大部分细胞飘起来，无法下一步的实验。

B: 如果干预前饥饿或者干预过程中饥饿，细胞本身状态也受到影响，假如我要观察一个因子对细胞某个蛋白 K 表达的影响，本身这种饥饿也会影响 K 蛋白的表达 。

C:假设我是瞬时转染的细胞，并且这种细胞长速非常快， 从50％到100％只需要24h甚至还不到24h。那么当细胞融合到70％左右进行瞬时转染，可能只剩下<24h的时间，细胞就100％融合了，根本就没办法饥饿overnight后再干预12h，而且瞬时转染过程本身是无血清转染的大概6h后换液，如果在外源因子干预前还要饥饿overnight，再加上外源因子干预的时间，等于细胞一直要在无血清状态下接近24h，那么转染进去的基因表达水平肯定也很低，因为缺少“营养”，细胞的表达效率肯定也是低下的。个人愚见！

如果战友有什么补充的请贴上来。
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发表于 2012-4-5 14:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在做外源因子干预细胞，按照文献要无血清培养饥饿18小时，可以使细胞同步化及减少血清的干扰。我试了试，我的肿瘤细胞饥饿了这么久可，加刺激因子后细胞生长可以，但是刚把RNA和上清提完，没跑PCR，不知道会是啥结果。
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kswl870[使用道具]
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发表于 2012-4-5 14:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的是肿瘤细胞株，饥饿应该对细胞状态影响不大，但是有些细胞一旦饥饿就导致飘起来或者死亡呢，那怎么办？而且你饥饿18小时，有的细胞因子干预时间还需要24小时，等于细胞持续饥饿了42小时，应该对细胞状态影响很大，就不符合生理状态下的变化了阿。

简单的细节，每个人的观点可能都不一样，集思广益。
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kswl870[使用道具]
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发表于 2012-4-5 14:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.不同时段的血清浓度变化：

A:细胞株: Hela细胞

B:干预前n小时（血清浓度）：血清浓度降低一半（正常培养是10%血清,改5％）

之所以改为5％，是因为我在转染的时候用的FUGENE HD，这个转染试剂可以带着血清转染，无需无血清转染，即使用10％血清转染效率也很不错。所以我就加了血清，而之所以由10％血清降为5％，是考虑到转染以后（从转染到收细胞总共24小时），后面还要外源因子干预，血清浓度太高可能会干扰有外源因子的干预效果（可能血清太高了会）。而且我转染－外源因子干预－收细胞，这个过程总共24小时，我是不换液的，避免反复换液影响细胞周围的生存环境。


C:干预过程n小时（血清浓度）： 同上（5％）

D：总干预时间？ 0－12h ，我是做promoter luciferase，参照文献的
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发表于 2012-4-5 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.不同时段的血清浓度变化：

A:细胞株: vsmc细胞

B:干预前n小时（血清浓度）：血清浓度10％）

C:干预过程n小时（血清浓度）： 同上（0.5％）

D：总干预时间？ 0－10h 仅供参考
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发表于 2012-4-5 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.不同时段的血清浓度变化：

A:细胞株: vsmc细胞

B:干预前n小时（血清浓度）：血清浓度10％）

C:干预过程n小时（血清浓度）： 同上（0.5％）

D：总干预时间？ 0－10h 仅供参考

——————————————————————————————

我的理由：正常血清浓度会干扰cell某些蛋白的磷酸化水平！
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发表于 2012-4-5 14:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议大家讨论时再详细些，如加入的是什么外源因子，检测哪些指标，实验结果（或预期结果）等。
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kswl870[使用道具]
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发表于 2012-4-5 14:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一些细小的环节往往会给实验结果带来很大的影响，因此建议版友们写的越详细约好，也相信版主会酌情对一些写的好帖子给与奖励的。呵呵，版主，我是不是有点越权了啊哈哈。

虽然这个问题貌似简单，但是我相信每个实验室的做法都不一样，包括我们经常看到的国外文献也是差异很大的，因此希望能引起共鸣，集思广益，寻求最合适的处理方法。
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loli[使用道具]
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 小中大

这个问题值得探讨，要不要干预，那些需要干预，哪些不需要？
过夜就可以吗？
个人觉得换为0.5%意义是否大。
肿瘤细胞过夜还可以，时间长了就不得行了
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bananapeople[使用道具]
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 小中大

我想请教下诸位大侠们，请问，用细菌干扰细胞怎么弄？我应该检测什么？
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