小中大用75%的乙醇浸泡10分钟， 这个步骤可以省略。
我们实验室，省略了这个步骤以后，细胞状态好多了。
另外，腹腔注射肝素钠3000u/只，我们从来没加过。
过程是 ：
1。 处死 4~6周小鼠。
2。 相对无菌条件下剥离双下肢皮肤、肌肉组织，取出并分离双侧股骨及胫骨，置入PBS
（PBS with 5% penicillin）
3. 1ml 注射器，10% FBS a-MEM （m-CSF free）. 这个步骤不需要加 m-CSF的.
4。冲洗骨髓腔至其内表面颜色发白;反复吹打冲洗液制备细胞悬液。
5。1000r/min离心5min
6。Gel solution : PBS = 3:1 反复吹打细胞（为的是破掉占骨髓细胞绝大多数的红细胞），肉眼观察，发现变色为止。
7。1000r/min离心5min
8。加入 10ml/2 mouse 的 比例加入 含5ng/mlM-CSF的10%FBS的 a-MEM. 吹打细胞。
9. 用70um 的 filter 过滤细胞。（目的是为了除去比较大的杂物及细胞）
10。 37℃、5%CO2 12 - 18小时。
11。 将上清夜，以 3plete/mouse的比例 重新接种细胞（30ng/mlM-CSF的10%FBS的 a-MEM）
12。37℃、5%CO2 3天。
13。 3天后，harvest.
11步骤，取上清的原因，楼上已经说明了，是为了除去贴壁细胞。
你以后，可能会慢慢明白，其实主要是为了分离 成骨细胞（osteoblast）.
因为，再 M-CSF 的刺激下，绝大多数 的干细胞都会 往破骨细胞方向发展，，这个过程当中，主要的杂质细胞，一般都是 成骨细胞。
做 osteoclast试验，时间长，步骤多，建立体系不是很容易。
希望，克服万难，早日成功！！
