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标题:[求助]小鼠脑血管内皮细胞培养

moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-4-9 14:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]小鼠脑血管内皮细胞培养




查了很多资料，但第一次培养还是有些问题不懂，请有经验的战友帮忙看看，不胜感激！

1.我做小鼠，一次要做多少只会得到比较多的血管段，我做3只是不是不够？

2.我用50%Percoll，有些资料说要预先25000g离心1小时才能用。我看说明书建议10000g离心15min。很多资料都没有提到离心，不知道这一步是不是很重要，目的何在？
加入细胞后梯度离心，有些建议低速400g离20-30min,而有些建议1000g离10min,哪个比较好？

3.离心之后我只看到很薄的红细胞层在最底部，根本没有看到黄白色的血管断层，我看有文献说这层少于1ml细胞数都过少，是不是和percoll没准备好有关？而且加入20%BSA离心后，我也只得到很薄层的沉淀，只贴15ml管底，是不是这一步已经出问题了？

请大家帮帮忙，谢谢！！
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-4-9 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
补充一个问题，原代培养后第一次换液是3天后吗，培养液全换？之后每3天换一半？
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-4-9 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你取的原代细胞可以纯化吗？实验室有师姐做过，没得到纯化的，反而被其他细胞占了上风，最后是购买的。
换液应该是根据细胞情况看吧，可以半换液。
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发表于 2012-4-9 14:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚刚做了一次原代培养，只有少量梭形细胞贴壁，也不知道是不是。
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发表于 2012-4-9 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你用的是两步消化法吗？我的Percoll是33%，感觉小鼠的话，三只少点吧？你取的是皮质吗？
还有培养基你加了嘌呤霉素了吗？
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-4-9 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是啊，我消化2次，先1h, 加BSA离心后，去上清，再消化半小时。
我尽量除去脑膜血管和白质。
我没加嘌呤毒素，很重要吗？我加了肝素。
你用33% percoll,能告诉我怎么配的吗？用前高速离心么？
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发表于 2012-4-9 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

抱歉，是我记错了，我也是50%， 3.5mlPercoll，0.39hank's,3.15D-hank's.嘌呤霉素可以去除其他杂质细胞。我离心了，25000g，1小时。离心很重要，要不连续梯度就出不来了，没有密度梯度，微血管就没法分出来。离心管一定要超高速离心管，大约20-40元一个吧。假如你没离心，估计是失败了。培基你的是什么啊？
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发表于 2012-4-9 14:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用M199+ 10%FBS + 100 ug/ml Heparin+ 2mM glutamine + 20ug/ml ECGS
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langlang[使用道具]
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 小中大

再请教你加入细胞后梯度离心用多大转数？1000g?
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 小中大

对，1000g，或3000rpm，10min
MCD131+ 10%FBS + 100 ug/ml Heparin+ 2mM glutamine + 10ug/ml ECGS+1%pen/strep,你的老鼠十几周的？两步消化时你加了Dnase I了吗？我想还是组织量不够，我做大鼠要用3只左右吧，小鼠应该更多。
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