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标题:[求助]fluo-3测钙,激光共聚焦标本

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]fluo-3测钙,激光共聚焦标本




请问，我用fluo-3标记细胞内的钙离子，想请问以下几个问题：
1.fluo-3标记后，是显什么颜色的荧光啊？分布在哪个位置呢?
2.激光共聚焦检测时，是用贴壁细胞还是先将细胞消化离心后用荧光剂孵化啊？
3.我是用24孔板培养细胞及添加药物，那每孔需要加多少fluo-3啊？

谢谢
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是绿色荧光吧
细胞最好是种在6孔板里,里面放上盖玻片,然后取出,制片.
说明书上好像是几个uM,不同的细胞不一样.
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那个，fluo-3需要无菌吗？
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

绿色荧光，整个细胞都会呈绿色；
贴壁细胞和细胞悬液都可以，但最好是用贴壁细胞做；
实验前先将flou-3am 配成1mg/mL，用来孵化时使flou-3am 的浓度达到10mg/L
我也是刚开始做这类实验，我QQ373316903，大家交流下，一起探讨探讨
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好像我试了下，悬浮的效果好一些吧？
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做出来也是悬浮的效果比较好，但是在观察的时候细胞会漂，进行药物刺激的时候，甚至会出现细胞漂出视野的情况，所以还必须得贴壁，我现在在摸索那种贴壁方法好一点
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baidukk[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，我用fluo-3标记细胞内的钙离子，想请问以下几个问题：
1.fluo-3标记后，是显什么颜色的荧光啊？分布在哪个位置呢?
2.激光共聚焦检测时，是用贴壁细胞还是先将细胞消化离心后用荧光剂孵化啊？
3.我是用24孔板培养细胞及添加药物，那每孔需要加多少fluo-3啊？

谢谢

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1.fluo-3染的是胞浆钙离子浓度，因此应该全细胞呈现荧光。共聚焦激发波长488nm，发射波长525nm（？不确定），呈绿色荧光；
2、既然是激光共聚焦，贴壁细胞还是比较靠谱点吧，如果是悬浮的话，最好用流式做（没做过）；
3、若用激光共聚焦检测的话，由于光的折射的问题，一个很大的问题就是与显微镜镜头接触（因为一般是油镜下观察）的透明介质的厚度必须非常薄。因此，用孔板或者培养皿直接在共聚焦显微镜下检测是检测不到的。2种解决办法：一是传代细胞之前就在孔板中央放置一个消毒后的盖玻片，细胞在盖玻片上贴壁之后方可进行染色以及进一步的检测。检测时应有一个专门的固定盖玻片的装置（我们实验室有一个，不锈钢的，巨贵），将盖玻片固定好后观察。此方法颇为繁琐，且成功率不高。第二个方法就是直接将细胞传代至专门用于活细胞共聚焦检测的培养皿中，这种培养皿直径35mm，底部贴有一个盖玻片。进口的比较贵，7个美刀一个，但可复用，盖玻片的质量也很好，不发愁贴壁问题；国产的（好像南京有个厂家生产）虽然便宜，5元左右一个，但质量真的很难恭维，显微镜下观察盖玻片上的划痕很多，而且出现细胞污染、不贴壁的情况也时常发生，还不能复用（泡在酒精中时粘贴盖玻片的胶就会溶解，盖玻片脱落）。
终浓度大约7个μmol/L即可。建议先把市售的fluo-3以dmso预溶解至1mM做为储备液，分装-20°C保存，使用时以含钙的Hank‘s平衡盐溶液稀释至7μmol/L即可。若用专用培养皿的话，只需在皿中央的小孔中滴入100μl左右的工作液即可。
good luck！
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-4-9 19:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
使用时以含钙的Hank‘s平衡盐溶液稀释至7μmol/L即可？？
请问，用HBSS稀释可以吗？我做的具体步骤是这样的，请各位看看，给予指点，谢谢
细胞贴壁后，PBS洗两遍，24孔板，然后加入配好的fluo-3/AM，200ul(我是用HBSS稀释的，浓度大概在4umol/L,可能浓度低了点，下次改正),37度避光30分钟，请问这样就可以了吗？还是需要别的步骤？
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utt0989[使用道具]
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 小中大
用HBSS应该也可以，HBSS,Tyrode,Hanks的成分都比较像,我在文献上也看到过有人用HBSS；
你应该还少了一步在室温下孵化，我把我的步骤写上来你参考下，做出来的荧光效果一般情况下都比较好。
钙敏探针孵育：
贴壁细胞用台氏液(Tyrode)清洗2次；
37℃下，用 Fluo-3 AM（10mg/L，实验前先将flou-3am 配成1mg/mL）避光孵育细胞30min；
细胞用Tyrode液清洗2次，在室温下再放置30min，使细胞完全负载上Fluo 3。
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dragonkilly[使用道具]
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 小中大

我做的结果，就是能看到荧光，但有很多细胞没染上，是不是还是步骤有问题啊？
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