液相色谱

　　【摘要】目的建立以高效液相色谱(HPLC)法测定双黄连注射剂中组分含量的方法。方法以甲醇-水(10%的磷酸溶液调节pH至2.7)为流动相，流速为 1.0ml/min，检测波长为326nm，在Diamonsil(钻石)C18(5μm,4.6mm×150mm)色谱柱上洗脱，外标法定量，黄芩苷含量可测定。结果黄芩苷在5.1～81.6μg/ml范围内呈良好的线性关系，r=0.9998，平均加样回收率为100.34%，RSD=0.82% (n=5)。结论该方法简便，灵敏，重复性好，结果准确，精密度较高，线性关系良好，回收率也较高，测定结果显示12h内黄芩苷稳定，适合于双黄连注射剂的质量控制。

　　【关键词】双黄连注射剂黄芩苷高效液相色谱法

　　双黄连注射剂是近年来研制的中药制剂，在临床上主要用于急性上呼吸道感染、急性支气管炎、急性扁桃腺炎、肺炎及急性尿路感染等，其疗效确切，安全，应用十分广泛。双黄连注射剂由金银花、黄芩、连翘3味中药提取制成，主要成分为黄芩苷、绿原酸、连翘苷等[1]。药理学研究已证实黄芩苷具有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、抗变态反应、解毒等作用;绿原酸具抗菌消炎、清热解毒等作用;而连翘苷则具有较强的抑菌、抗病毒的活性。

　　双黄连注射剂黄芩苷含量测定的方法主要有高效液相色谱法、薄层扫描法、紫外分光光度法等，高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快且精准等特点，适合中药成分的多样性及复杂性，在双黄连制剂的质量控制上应用也最多。本文通过优化色谱条件测定黄芩苷的含量，以期为进一步研究双黄连注射剂中绿原酸及其它成分打下基础，为双黄连注射剂工艺研究和质量控制提供理论基础。

　　1仪器与试剂

　　1.1仪器Agilent1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司);TU-1800紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责公司);KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电子天平(上海精科天平);予华SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂);Diamonsil(钻石)C18色谱柱 (5μm，4.6mm×150mmCat.no：9990Ser.no：8011571DikmaTechnologies)。

　　1.2试剂双黄连注射液(批号Z23021166黑龙江乌苏里江佳大制药有限公司);黄芩苷化学标准品(批号110715-200514,中国药品生物制品检定所);色谱甲醇(天津大茂化学试剂厂);分析纯甲醇(天津市北方天医化学试剂厂);磷酸(河北省保定化学试剂厂)。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件Diamonsil(钻石)C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm),流动相为A-甲醇(色谱纯)：B-蒸馏水(50∶50)，流速为1.0ml/min，检测波长为326nm，进样量20μl。其分离色谱见图1～2。

　　2.2溶液的制备

　　2.2.1标准品溶液的配制精密称取黄芩苷标准品0.005100g至50ml容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容至刻度，超声至其完全溶解。配制成浓度为0.102mg/ml的储备液放入冰箱，低温储存。

　　2.2.2供试品溶液的配制用0.1ml的移液管从双黄连注射液中精密吸取0.05ml至10ml容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容至刻度，超声10min使溶解。再用0.45μm的滤膜过滤至用铬酸洗液浸泡3h并干燥好的10ml比色管中，扭紧塞子。

　　2.3线性关系考察精密量取浓度为0.102mg/ml黄芩苷标准品储备液0.5，1，2，4，6，8ml分别至10ml容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容至刻度，配制成浓度为5.1，10.2，20.4，40.8，61.2，81.6μg/ml的一系列标准溶液后，再用0.45μm的滤膜过滤至用铬酸洗液浸泡3h后干燥好的6支10ml比色管中，扭紧塞子。按上述色谱条件进行测定，每个浓度的黄芩苷标准液测3次。根据3次峰面积的平均值，求黄芩苷的标准曲线。结果见表1，黄芩苷在5.1～81.6μg/ml浓度范围内呈良好线性关系。回归方程为Y=41.409X-132.35，r=0.9998。

　　2.4加样回收率测定用1.0ml的移液管从双黄连注射液中精密吸取1ml至100ml容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容，并超声10min使其完全溶解。从中吸取5ml至10ml容量瓶中，共5份，各精密加入黄芩苷标准品储备液 0.051，0.102，0.204，0.306，0.357，0.510mg，用甲醇(分析纯)定容至刻度，并超声10min使其完全溶解，按上述色谱条件进行测定，根据峰面积，计算黄芩苷含量，并计算黄芩苷的平均加样回收率。结果见表2。表1黄芩苷的线性关系考察实验数据表2黄芩苷的加样回收率实验结果

　　2.5精密度实验取双黄连注射液1支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液1份，按上述色谱条件进行测定，共进样5次。结果见表3。表3黄芩苷的精密度实验结果

　　2.6重现性实验取同一批号双黄连注射液5支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液5份，按上述色谱条件进行测定。结果见表4。表4黄芩苷的重现性实验结果

　　2.7稳定性实验根据供试品溶液的配制法配制样品溶液一份，在室温下放置，分别于0，3，6，9，12h时按上述色谱条件测定一次峰面积，实验结果RSD=1.22%，表明黄芩苷在12h内稳定，结果见表5。表5黄芩苷的稳定性实验结果

　　2.8样品含量测定根据供试品溶液的配制法配制样品溶液，按上述色谱条件进行测定。经实验测得双黄连注射液中黄芩苷的含量为7.1mg/ml。结果见图1～2。

　　3讨论

　　双黄连注射剂的不良反应源自中成药的复杂成分，如金银花中所含有的绿原酸和异绿原酸，不仅具有抗菌抗病毒作用，又具有致敏原作用，可引起变态反应，是引起过敏反应的主要原因之一。童路[2]报道双黄连针剂引起的过敏反应与黄芩苷有关，毒性反应与黄芩中的另一种成分有关。

　　图1黄芩苷化学标准品HPLC图

　　图2样品HPLC图

　　黄芩苷与绿原酸的极性相差极大，在质量标准中也只规定两者含量分别测定，用HPLC法同时测定两者含量，多采用梯度洗脱法逐渐降低流动相极性的方法,而吸收波长一般选择326nm，以提高绿原酸的灵敏度。黄芩苷的HPLC测定，其流动相有甲醇∶水∶冰醋酸(5∶50∶1);甲醇∶水∶磷酸 (50∶50∶0.2);异丙醇∶甲醇∶3%的醋酸(5∶30∶65);甲醇∶0.5%三乙胺(75∶25)系统。而在2005年版《中国药典》中黄芩苷的色谱条件与系统适用性试验为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇∶水∶冰醋酸(50∶50∶1)为流动相，检测波长为274nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于1500。但我们在实验条件摸索过程中发现，流动相采用甲醇∶水(用10%磷酸调节pH至2.7)，比例定为50∶50，黄芩苷与注射液中其它组分分离良好，并且能减少磷酸盐对泵的侵蚀等。

　　双黄连注射剂中主要成分分析方法报道很多[3～5]，但制剂中其它成分分析方法少见报道，本文旨在通过黄芩苷的分析测定，进一步找出其中各种成分的分析、分离方法，探讨双黄连注射剂不良反应的原因。

挺有研究性的，谢谢分享