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标题:[求助]稳定转染的鉴定？

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发表于 2012-4-11 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]稳定转染的鉴定？




用pEGFP-N1构建的真核表达载体，目的基因片段长度1700bp左右。
筛选了稳定转染的细胞株，RT-PCR检测，用了检测引物，是目的基因中间的一段，长度700左右。
是否还应该检测全长（1700bp）呢？要扩全长，得用prime star酶，有点小贵，好像也不好扩。万一1700bp扩不出来呢？有点担心。
兄弟姐妹们，支点招吧！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-4-11 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.你的载体不是带荧光么？有荧光了难道不可以证明么？
2.可以做WB证明么，一定要PCR？
3.P其中一段不可以么？高表达了就说明整合了啊，一定要P全长么？
4.P全长一定要用primer star么？p出那个位置条带加深了就行了啊，又不要测序的
5.primter star价格还好吧~~
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发表于 2012-4-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只P其中一段就可以了吗？
答辩的时候，万一评委问我你为什么不P全长来鉴定，我应该怎么回答呢？
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发表于 2012-4-11 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得能问出这样问题的人，可能离评委的水平还差一点
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发表于 2012-4-11 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

为了保险起见，我P了全长，也P了中间一段序列
发现转染后细胞p中间序列的全部可以P出来，可是P全长出不来，说明我没转进全长吗？
多谢大家指教！
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发表于 2012-4-11 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你怎么判断你的稳定转染的？细胞有荧光吗？
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发表于 2012-4-11 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有啊，但是稳定转染时有可能随机整合到细胞中的是目的基因的片段，而不是全长吗？
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发表于 2012-4-11 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不太可能。除非你线性化了，并且是用酶片段里有。。。。真不太可能。
不过，这个细胞里没有内源性表达么？全长为什么p不出来呢
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发表于 2012-4-11 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
细胞里应该没有内源性表达，用短的片段和长的片段都P过啦，没有
不知道转进去的目的基因会不会不稳定呢？
我们做western检测，这个蛋白应该是61kd，可是我们做出来只有50kd左右，western做了快一年了，还在纠结中。。
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-4-11 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

晕，转进去的难道不是全长？你可以做pcr的时候，用下你做转染的质粒做个对照。10ng模板就够了。质粒表达的一般情况下不会剪切吧，而提前终止有时候在原核表达的时候才会出现啊，你还是先用质粒p个全长看看吧
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