小中大[求助]关于细胞爬片做免疫荧光的系列思考与疑惑
我养的是原代内皮细胞，最近将其做细胞爬片，然后做CD31的免疫荧光。遇到的问题是：
1、虽然小盖玻片也经过泡酸、明胶包被等系列处理，但是细胞在玻片上的长势还是不如在塑料上。当塑料上已接近融合时，玻片上还是星星点点的。在消化传代时，皿里的细胞死爬在上面，很难消化下来——不是细胞状态不好吧？
2、最头大的是很多次的掉片问题。玻片上的比塑料上的容易掉。而且，我以为固定以后就不会掉片了，其实不然，在加完二抗后也会掉。就会看见玻片上有一小白点，就知道不妙，放显微镜下一看，细胞找不到了。冲洗我已经很小心了，是加在玻片外面的边上，让水滴就着重力作用滚下来浸过玻片。只有加抗体时是慢慢滴到玻片上的。之后就在塑料皿里直接做，发现掉片是整片的卷起来，就像蜕皮一样。我加液体是加在皿壁上的。
3、既然玻片不好，为什么没有塑料片代替呢？搜了下只有那种很贵的做FISH原位杂交的塑料片，还可以裁剪还已经灭菌好了的，就是太贵了。其他我们平时用的塑料怎么就不行呢？
4、明胶包被，我觉得0.2%已经够了（根据sigma的说明书推算）。是不是在玻片上需要浓度更高些？还是多聚赖氨酸防脱片效果更好？
5、固定方法，我用的是95%酒精。固定剂很多，有用多聚甲醛有用95%酒精。既然95%酒精是最常用的，而且容易获得，多聚甲醛很难溶，配起来费劲，而且只能放2周，为什么还有很多文献用的是多聚甲醛呢？是否它对维持细胞形态更好呢？
6、做免疫荧光中，每步的PBS洗涤，是否一定要严格那么多时间？起先我都用的计时器，后来就马虎了。不知道大家怎么做的
7、细胞在固定后还脱片，不知道这正常不正常
8、关于细胞生长密度多少适合做免疫荧光的问题。一般文献里说是80%左右。我用生长非常密集的细胞做，本以为可以出来满视野的荧光，结果什么都没瞧见。是因为荧光给一层层的细胞挡住了，还是细胞本来就发生变化或者就不是我要的细胞？接触抑制影响细胞抗原的表达吗？
9、为什么细胞达到融合之后就要传代？融合后发生接触抑制细胞停止分裂，但是不会死亡吧？我的细胞长的很密放在那里1-2周，也没什么变化。液体颜色变化很慢。我以为死了，结果加了胰酶，又一个个收缩了，可以传代。那这样，是不是就可以不用冻存了？
10、细胞爬片做免疫荧光，是不是可以不用过氧化氢灭活内源性过氧化物酶？因为后面没有用到DAB显色。
11、观察时，荧光很弱。在我试验室这间的荧光显微镜看得到荧光，而到成像那边的荧光显微镜却看不到荧光。我看了下能看到荧光的镜头是40*，上面写着fluo什么的，这是专看荧光的镜头吗？或者对荧光敏感？我需要拍同一视野的明场，但是发现，看荧光好的镜头看明场细胞立体感很不明显，不如低倍的，而低倍的镜头看不到荧光。很糟糕。
问题太多了，希望能帮帮我，大家能说多少就说多少吧
