蛋白质与蛋白组学

　　一、原理

　　利用硫酸及催化剂与食品试样一同加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2、H2O 逸出，而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。然后将消化液碱化，蒸馏，使氨游离，用水蒸气蒸出，被硼酸吸收。用标准盐酸溶液滴定所生成的硼酸铵，从消耗的盐酸标准液计算出总氮量，再折算为粗蛋白含量。

　　2NH2-(CH2)2-COOH + 13H2SO4 → (NH4)2 SO4 + 6CO2 + 12SO2 + 16H2O

　　(NH4)2 SO4 + 2NaOH → 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

　　2NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2 B4O7 + 5H2O

　　(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O → 2NH4Cl + 4H3BO3

　　二、仪器与试剂

　　1、凯氏定氮仪

　　2、试剂

　　硫酸铜 硫酸钾 硫酸 2%硼酸溶液

　　混合指示剂:0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%甲基蓝乙醇溶液,临用时按2:1的比例混合.或0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液,临用时按1:5的比例混合。

　　20%NaOH溶液 0.01mol/L HCl标准溶液

　　三、测定方法

　　1、样品消化：

　　准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.3g左右，小心移入干燥的消化管中(勿粘附在消化管壁上)，加入0.5g CuSO4、3g K2SO4及10mL浓硫酸，于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽出消化过程所产生的烟气。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化，泡沫消失后再加大火力，消化至溶液透明呈蓝绿色。取下抽气管，继续加热 0.5h,冷却至室温。

　　取20mL蒸馏水，徐徐加入烧瓶中，待样品冷至室温，移入100mL的容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧瓶数次，并入容量瓶，旋转混匀放冷，再用蒸馏水定容，备用。

　　同时做一空白消化。

　　2、蒸馏与吸收：

　　蒸馏器中,碱液及蒸馏水采用电磁泵加入,NaOH(碱)、H2O(水)注入接口用橡胶管套入后分别置入自备的容器中,加液时按面板上相应开关,液体由泵吸入消化管内,注入毫升数视标尺所注位置而定。(一般碱液加量是消化时硫酸用量5倍以上，加蒸馏水量15毫升左右)

　　1)打开电源,打开自来水龙头,接冷却水自来水龙头不必开过大，出水口有水流出即可,用排水管子上夹子夹紧排水管子。

　　2)按下蒸汽开关，蒸发炉内水由冷却水接口通过冷凝管，经平稳器慢慢流入，由于蒸发炉水位不断上升，使电极板之间电流逐步增加，水温通过加热而上升，但由于初态时水温较低，水位迅速上升，蒸汽尚未能马上产生，电流急剧增加，造成熔丝管断裂，待电流表指向5A时即释放蒸汽开关，待指针回落到零时，再按蒸汽开关，反复几次。等蒸汽开关正常喷出，电流表固定在4-5A时，即开始正常蒸馏。

　　3)在250mL三角接收瓶中加入50mL2%H3BO3和2-3滴混合指示剂,蒸馏时间设定在6-8分钟，并使接收瓶托架盘往上移,然后按时控控制按钮，使托盘内电磁铁固定在接收位置。

　　4)向上扳动侧面红球手柄把消化管固定在左边托架上，然后按面板上开关分别加入 H2O(水)、NaOH(碱)液体，然后开启蒸气开关，向试管内注入蒸气，进行蒸馏样品，在接收瓶内接收液达150毫升左右时移下接收瓶，用蒸馏水冲洗滴管口继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。第二个样品只要放上后，加好后，开启蒸汽开关即可，不要关电源。

　　3.滴定：

　　用0.01mol/L HCl滴定吸收液至变为红色为终点，记下消耗的HCl体积。