细胞世界

最近我发了一篇文章，做某一个基因在细胞膜中的表达，用细胞免疫荧光方法，但审稿人问为何不用免疫荧光双标呢？不知单标和双标有何区别。谢谢！！

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做一个基因的表达，一般都是做单标吧，只有做两个不同基因的时候才分别用不同的荧光抗体标记，以示区别。
顾名思义，单标就是一个抗体标记，双标是两个不同抗体标记不同基因，从而观察两个基因的表达，定位等等~~~~

这是审稿人的意见
Analyzing the subcellular localization of proteins generally requires co-localization with accepted markers and/or confocal imaging.

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他的意思是说，你要给个膜蛋白的marker。这个你要查查看，那种染料是专门染膜蛋白的。
要证明一个蛋白定位在膜上需要严谨的证明。
比如说可以分膜蛋白和包浆蛋白提取，wb证明只在膜fracion中有你的蛋白，而cytoplamic中没有。还可以用surface biotion方法，提取膜蛋白，再杂你的目标蛋白。再有就是用你的免疫荧光的方法。但你这个方法要注意你的抗体是针对蛋白的哪部分的，这部分是在胞外呢，还是在胞内呢，还是跨膜区，这样出来的结果都是不同的。最好是表达一个N端和C端都带不同tag,比如myc,his ,用这些抗体做，会比较好。还有就是做IP了，抗体直接和living cell 孵育（不裂解细胞），再拉，如果能拉下来，就是膜上了。
随便说说啊。瞎出点主意。哈哈。

这是审稿人的意见
Analyzing the subcellular localization of proteins generally requires co-localization with accepted markers and/or confocal imaging.

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你是否只用普通荧光显微镜拍了？人家不是说了吗，有共聚焦就行，大不了再用DIO或DIL染下细胞膜，再上共聚焦，证据已经很充足了。很简单的，碧云天有试剂。提细胞膜很麻烦！

他的意思是说，你要给个膜蛋白的marker。这个你要查查看，那种染料是专门染膜蛋白的。
要证明一个蛋白定位在膜上需要严谨的证明。
比如说可以分膜蛋白和包浆蛋白提取，wb证明只在膜fracion中有你的蛋白，而cytoplamic中没有。还可以用surface biotion方法，提取膜蛋白，再杂你的目标蛋白。再有就是用你的免疫荧光的方法。但你这个方法要注意你的抗体是针对蛋白的哪部分的，这部分是在胞外呢，还是在胞内呢，还是跨膜区，这样出来的结果都是不同的。最好是表达一个N端和C端都带不同tag,比如myc,his ,用这些抗体做，会比较好。还有就是做IP了，抗体直接和living cell 孵育（不裂解细胞），再拉，如果能拉下来，就是膜上了。
随便说说啊。瞎出点主意。哈哈。

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正解