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标题:[讨论帖]“细胞培养心得

ritou1985[使用道具]
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[讨论帖]“细胞培养心得



养细胞有3年了吧,虽然最近不用我接手了。从一开始跟师傅学,到最后有了自己的养细胞方法,经历很多挫折,也收获了把细胞养好的喜悦,
从做徒弟开始,可以很荣幸的说,到现在从没又把细胞污染过,从悬浮,贴壁,半贴壁。最后总结出一句话“养细胞就跟养孩子一样”,你不用心传的话,两天就会长得乱七八糟。记得一开始做鸡纤维细胞,两个鸡胚铺的细胞都长不满,做试验根本没法做,好歹连续做了两个周,才掌握了方法,板底铺的正好。
细胞做多了,他也就熟悉你的脾性,你也就熟悉他的脾性了,嘿。。。还是那句话“养细胞要跟养孩子一样”O(∩_∩)O哈!
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33号[使用道具]
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2
 
记得养细胞是在5年前,经常要换液,我的一个师兄忙毕业论文,我这个人也是闲着没事干,就接下了这个任务。因为每次细胞出现不贴壁,就打电话给师兄来处理。
后来到一家公司,我们也进行细胞培养。主要进行一个产品的活力测定。由于这个产品在市场上基本是独家销售,利润空间很大。但是出于其他方面的考虑,生产的批次还是较少的,活力测定很少测定,后来药检所要抽样检验。当时药检所也没有专门的细胞活力测定的实验室,所以就要到我们公司进行试验。
于是试验就在公司开展,由于这边基本上不做这个实验,买耗材和试剂成了一个很大的麻烦,因为很多试剂代理商看到这些实际量少以及种类较多,基本上都是回绝了。郁闷,但是在我原来的实验室通过关系“免费赞助”了一批。试验终于开展起来了。
试验终于开展起来了,药检所来了一个漂亮妹妹来监督试验,晕!她不做实验,而是监督。由于刚开始做,首先是细胞的解冻接种培养,不是不贴壁,就是不生长,郁闷!她也鼓励我们说细胞培养是很难,她曾经在学校培养了半年的细胞才最后进行试验的,她主要是培养神经细胞的。后来向师兄打听,说神经细胞是很难培养的。也就是说她是一个高手啊!
既然有高手,就有压力以及有一个好的老师在旁边。试验开展到最后活力测定了。在试验最后一步,看到细胞染色的情况,真是让我冷汗差一点出来了。后来进行酶标仪读数时看到有一些数字和空白值一样,真是悬啊!如果试验失败那就是公司要召回产品,损失惨重啊!随着扫描读数结束,心终于落地了,试验结果很好!那个药监局妹妹说我们操作很好!
我们的产品最好终于放行了,老板也没有提出奖励,感觉是应该的。接着我们继续剩勇追穷寇进行了其他品种的细胞活力测定,并着重进行培训。现在细胞培养几个人终于可以很熟练的操作了。
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caihong[使用道具]
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3
 

细胞培养做了很多年,遇到最多的麻烦就是长菌。
个人体会:
1.见好就收
如果细胞状态好,赶紧冻存一批。当出现污染或细胞长得不好时,可以重新复苏细胞,从头再来。
2.时刻保持低调
细胞出现污染往往在自我感觉越来越好的时候,千万不要骄傲。认认真真做好每一天的工作。
3.细节决定成败
细胞培养的每一个环节出现问题都有可能影响到细胞的生长,不能放松。
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lixi559[使用道具]
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痛并快乐的养了好几年细胞了,污染数不胜数啊~
我养的细胞污染过:霉菌—长得像朵蒲公英,漂亮啊~~可惜长在了我得培养皿里。
放线菌:有很长的丝,是放线菌吧?
细菌:细细黑黑的,还会游动,一天就长满了。好恶心
不知道什么的菌: 黑色的流沙状的,好象我还在这儿问过。
大部分情况下,污染了赶紧扔,别影响其他细胞就行。污染主要是操作的问题,如果担心培养液有问题,可以取一点放在新的35mm小皿里,在培养箱放一天看看。或者1:1加LB培养基,37度摇床过夜检测。
霉菌我试过挽救,挑出去换液,不过没去干净,第二天四处开花,只好扔了。
流沙状的那种污染,我用PBS洗了好多遍,种在96孔板里,长是长起来了,快长满6孔板的时候突然又满孔流沙淹没细胞了。看来,这个方法也没用,以后可以直接仍了。
总之,污染之后挽救,远如不操作的时候小心,需要的东西在超净台里准备好照上,总拿进拿出容易把外面空气里的菌带进去。还有东西位置规划好,别把袖子在需要无菌的东西上面晃来晃去。
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glass[使用道具]
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5
 
细胞真是个头疼的玩意~~当初是为了帮师姐的忙,才进的实验室。对分子生物一点不感兴趣,却喜欢上了培养细胞,可是这确实最大的考验。
细胞培养的前期工作很长,小鼠,培养基,灭菌......实验进行也只是短短的几小时,可是花费在前期工作的时间确实无法计算的。当一切准备就绪,也可能一点的疏忽让所有的细胞无法生长~~~
当初冻存小鼠成纤维细胞实验已经成型,可是有一天开始突然复苏细胞的生长状态很不好,我寻找了一年的时间改进方法,终于把冻存液配方以及冷冻程序改良后才恢复原来的状态。这里也把我的冷冻方法告诉大家一下吧:胎牛血清:DMSO=9:1,四度冷冻30min,-20度冷冻1小时,转到-70度,过夜第二天存入液氮中。也可以选择程序冷冻盒,但是感觉没有这个效果好呢。
记得有几个月我培养的细胞都没有菌生长,实验室其他人的细胞都不同程度的长菌,而且他们长菌的细胞给我,我也能挽救回来。就这样自己就飘飘然了,和老师夸口说自己养细胞从来没长过菌。可仅仅是第二天,和同学喝的迷糊的就去做实验了,自己感觉喝的还不算多,可是手却发抖了。果然可怜的293GP就被我弄得不像胞样了~~全是菌样~~哈哈!
细胞这个孩子还得住的好地方~~我们实验室以前一直用一个红色盖子的培养瓶,7元一个,也不便宜~~可是后来用了一个蓝色BD的培养瓶,这些细胞就喜欢上BD的了~再用以前红色培养瓶就不好养了,真是奇怪~~有时候用BD的瓶子装点胎牛血清,可是感觉那个瓶子是不是太好了,可能有透气性,喷喷酒精就发现血清颜色不正常了~~弄得细胞很久都吃不好~唉!
有的时候为了避免长菌,自己就使劲往手上喷酒精,然后再戴手套再喷,可是又一次竟然用了工业酒精,杂质超多,弄得手感觉火辣辣的难受~~唉,也没有工伤钱,可怜的细胞人!
就是这样的我们成就了中国的生物产业~就是这样的我们才能让BOSS发出SCI,不知道什么时候才是我们这样人的天下,愿所有养细胞的人都能顺利,不长菌,满贴壁,形态好,多发SCI!!
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greenbee[使用道具]
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我养细胞也两年多了,刚开始的时候很痛苦,啥也不会,很多东西都没有见过,很迷茫,没开始一个新实验都要紧张好几天。在这种情况下,在实验之前往往需要查阅大量的资料。对整个实验的原理,操作细节都要在头脑里反复演练几遍。在过去的两年中,我基本都是这样过来的。以我养EPC的经历为例,什么时候第一次细胞换液?针对这个问题,我看了很多文献,各个文献的说法很多不一样,从中我了解了EPC换液的一些情况,然后有了一些自己的经验。同样,关于单个核细胞的接种密度的问题,我也是查了很多的资料,最后才有了自己的经验。我的实验也取得了成功。那是相当的喜悦!------准备要充分!

当然,我也有失败的时候。有一次,自己想偷懒,将原代培养-传代培养-细胞换液同时做了,当时超净台上也是一团糟,结果那批细胞全部给污染了,直接的结果就是2个月的劳动全部白费了。当时实在是太郁闷了!那次的教训告诉我,就是实验一定要注意细节,不要心急!--要有耐心,要注意细节!

要多听听别人的意见,但是别人的意见不一定正确,要自己摸索和思考,要多阅读!
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一叶[使用道具]
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我进实验室的第一件事就是进行的细胞培养,到目前为止,已经8个年头了。中间确实经历了坎坷和喜悦。要知道,如果你的细胞成为大家参观和崇拜、学习的对象,那是多么自豪的一件事。
下面将我这几年来样细胞的经历和感想跟大家交流一下。
1、启蒙老师的重要性。父母是人生的第一/最好导师,说明了启蒙老师的重要性,尤其是在孩子的教育上。细胞培养也是如此。一般进实验室都有师兄带着做,师兄就是你做细胞的启蒙老师。他的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则,如营养液、细胞瓶的摆放位置;灭菌处理程序;开盖手法;细胞吹打手法等等。俗话说,名师出高徒,强将手下无弱兵,就是这个道理。第一次最重要!
2、永恒的细心和耐心。开始做细胞,在师兄的带领下,一般在细节上都很注意,细胞一般也长的不错。然后就有点飘飘然,自认为不也就这么容易嘛。然后就会放松警惕和要求,后果马上就会出来了。轻则细胞状态不好,重则细胞污染,营养液污染。
3、好细胞要及时保种。刚开始做细胞,有些问题不是很懂。有一次,老板从别处拿来一瓶细胞,让我培养。状态非常好,我就一直传代,都有十几瓶了,后来由于失误,结果全部细胞都污染了。结果可想而知——一顿很批。也许早问一下,早冻存也不会出现这种情况。还有当时嫌麻烦,老板说过多次,细胞要分批传代,这样即使有一批出了问题,还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。尤其实验室超净台紧张、利用率高的情况下。
4、特殊情况下更需注意。细胞培养时间长了,人总会有点自以为是,飘飘然。有一次,晚上那个喝了点酒,因为第二天要转染,所以,晚上要把细胞传代一下。自以为没事,传个细胞还不容易。结果第二天就污染了。就像前面战友提到的情况。当时多亏还有其他没有传代的细胞。
5、每种细胞都有自己的特性,要区别对待。细胞跟人一样,不同的细胞,培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。如高糖/低糖DMEM、胎牛血清、新生牛血清、马血清、含/无丙酮酸钠、RPMI-1640等。
6、培养前的工作准备充分。包括耗材的处理、试剂的配置,无菌检验等等。
(1)玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿(细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等)要先用洗衣粉刷干净(注意死角),然后冲干净。用酸液浸泡24h以上,之后用清水冲洗10遍,除去残留酸液。瓶子之类,冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡24h。晾干后包扎,160度干烤2h待用。
(2)试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意pH值的调节。
(3)无菌检验。主要采用过滤除菌:如胰酶、抗生素、G-418溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌:如PBS、D-Hank's等。
7、试剂分装保存。包括营养液、胰酶、血清等。
血清特别重要。血清必须贮存于–20℃,如果一次无法用完一瓶,可将40~50ml 分装于无菌酸处理瓶中,甚至置青霉素瓶保存。
一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。(一般情况下不影响细胞培养)
瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃冰箱全溶后再分装,在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到56度后,将血清放入,待温度升高到56度后计时,一般5分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份 去活化。除非必须,一般不要作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。注意更换新血清(包括不同批次)对细胞的影响。
8、细节决定成败。实验进行前,超净台以紫外灯照射30分钟灭菌,以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启超净工作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置,其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以70%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域,一般勿在边缘区域操作。
小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
9、注意安全。包括泡酸处理,超净台的酒精灯、打火机。
10、多问、多看、多思考、多改进、多总结。
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细胞培养做了很多年,遇到最多的麻烦就是长菌。
个人体会:
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如果细胞状态好,赶紧冻存一批。当出现污染或细胞长得不好时,可以重新复苏细胞,从头再来。
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细胞出现污染往往在自我感觉越来越好的时候,千万不要骄傲。认认真真做好每一天的工作。
3.细节决定成败
细胞培养的每一个环节出现问题都有可能影响到细胞的生长,不能放松。

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说得好
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kulee[使用道具]
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我养细胞已经4年了,现在还在养!
刚进实验室的时候,连枪都不会用,打电话问师姐,现在想想很好笑!
我的经验是,养细胞非常需要经验!
首先是培养液,尤为关键,吃的不好,细胞是不会长好的!所以不要在这方面省钱,GIBCO的血清和瓶装培养液还是不错的,这么多年一直用它;
其次是培养瓶和培养板,个人觉得CONING的还不错!
细胞这东西,要大胆而心细,需要每天想着它,但也要给它时间,我们要耐得住性子,平和心态。只要坐在超净台前,就要一切准备工作就绪,绝不能手忙脚乱,尤其在原代培养时,而且建议一次只做一种细胞株的原代培养。(我曾经一次做了9只猪胎儿的成纤维细胞培养,累的半死,只活2只猪的,其余的都污染)细胞冻存之前,一定要预留培养,避免发生冻存失败而前功尽弃。
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sunnyB[使用道具]
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说起养细胞,我还只是个新手,到现在10个月了,养过PC12和SP2/0,相对来说还是好养的。
养细胞最重要的就是请教经验~不是网上查查的方法马上就可以用上的,总是尝试许久,得到适合自身实验室的条件的方法才能成的,所以养细胞的苦楚,只有我们这些细胞人才体会的到~~

细心是最最重要的,污染往往就是一个不留神~另外千万不要抱侥幸心理,如果可以,尽量多换枪头,换玻璃管什么的,一但有问题,后果很严重~

最后祝所有养细胞的朋友们顺利!
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