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我进实验室的第一件事就是进行的细胞培养,到目前为止,已经8个年头了。中间确实经历了坎坷和喜悦。要知道,如果你的细胞成为大家参观和崇拜、学习的对象,那是多么自豪的一件事。
下面将我这几年来样细胞的经历和感想跟大家交流一下。
1、启蒙老师的重要性。父母是人生的第一/最好导师,说明了启蒙老师的重要性,尤其是在孩子的教育上。细胞培养也是如此。一般进实验室都有师兄带着做,师兄就是你做细胞的启蒙老师。他的操作手法、细节、理论讲解就成了你操作的准则,如营养液、细胞瓶的摆放位置;灭菌处理程序;开盖手法;细胞吹打手法等等。俗话说,名师出高徒,强将手下无弱兵,就是这个道理。第一次最重要!
2、永恒的细心和耐心。开始做细胞,在师兄的带领下,一般在细节上都很注意,细胞一般也长的不错。然后就有点飘飘然,自认为不也就这么容易嘛。然后就会放松警惕和要求,后果马上就会出来了。轻则细胞状态不好,重则细胞污染,营养液污染。
3、好细胞要及时保种。刚开始做细胞,有些问题不是很懂。有一次,老板从别处拿来一瓶细胞,让我培养。状态非常好,我就一直传代,都有十几瓶了,后来由于失误,结果全部细胞都污染了。结果可想而知——一顿很批。也许早问一下,早冻存也不会出现这种情况。还有当时嫌麻烦,老板说过多次,细胞要分批传代,这样即使有一批出了问题,还有一批备用的。像后者一般人可能不容易做到。尤其实验室超净台紧张、利用率高的情况下。
4、特殊情况下更需注意。细胞培养时间长了,人总会有点自以为是,飘飘然。有一次,晚上那个喝了点酒,因为第二天要转染,所以,晚上要把细胞传代一下。自以为没事,传个细胞还不容易。结果第二天就污染了。就像前面战友提到的情况。当时多亏还有其他没有传代的细胞。
5、每种细胞都有自己的特性,要区别对待。细胞跟人一样,不同的细胞,培养特性是不一样的。培养过程中要细细体会。不同细胞株使用不同的培养基和血清。如高糖/低糖DMEM、胎牛血清、新生牛血清、马血清、含/无丙酮酸钠、RPMI-1640等。
6、培养前的工作准备充分。包括耗材的处理、试剂的配置,无菌检验等等。
(1)玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿(细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等)要先用洗衣粉刷干净(注意死角),然后冲干净。用酸液浸泡24h以上,之后用清水冲洗10遍,除去残留酸液。瓶子之类,冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡24h。晾干后包扎,160度干烤2h待用。
(2)试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意pH值的调节。
(3)无菌检验。主要采用过滤除菌:如胰酶、抗生素、G-418溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌:如PBS、D-Hank's等。
7、试剂分装保存。包括营养液、胰酶、血清等。
血清特别重要。血清必须贮存于–20℃,如果一次无法用完一瓶,可将40~50ml 分装于无菌酸处理瓶中,甚至置青霉素瓶保存。
一般厂商提供之血清为无菌,不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物,则可将血清加入培养基内一起过滤,勿直接过滤血清。(一般情况下不影响细胞培养)
瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃冰箱全溶后再分装,在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到56度后,将血清放入,待温度升高到56度后计时,一般5分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份 去活化。除非必须,一般不要作此热处理,因为会造成沉淀物之显著增多,且会影响血清之品质。注意更换新血清(包括不同批次)对细胞的影响。
8、细节决定成败。实验进行前,超净台以紫外灯照射30分钟灭菌,以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面,并开启超净工作台风扇运转数分钟后,才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞,必要物品,例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置,其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以70%乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域,一般勿在边缘区域操作。
小心取用无菌之实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45° 角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
9、注意安全。包括泡酸处理,超净台的酒精灯、打火机。
10、多问、多看、多思考、多改进、多总结。