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标题:[求助]带有GFP的细胞进行凋亡和坏死检测...

bluelake[使用道具]
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发表于 2012-4-16 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]带有GFP的细胞进行凋亡和坏死检测...



各位好，我最近在做带有GFP的细胞的凋亡和坏死检测，但附近的单位我都找遍了，流式细胞仪都只有488nm的激光激发通道，这意味着我只能在488nm激发的染料中选择。细胞自带GFP，而用GFP+annexin-V+PI三色标记的策略的话，annexin-V所标记的染料就只能是PE、PreCP等少数几种，问题是：
1.Annexin-PE和PI组合，两者在发射光波长上是否太接近了？PE是550，橙红；PI是610，红。
2.另外对于常用的Annexin-FITC/PI组合，我觉得在都是绿色荧光的问题上，FITC与自带的GFP会互相干扰，甚为不妥。
3.在搜索丁香园中各位跟我类似的情况中，我还看到一个组合是Annexin-PreCP/PI，但前者我在网上找了好久，MS没有卖这个的，或者说是价格十分昂贵的，而且，PreCP也是红色的。
4.还有没有别的组合能用？

烦请各位长辈指教，在下感激不尽~！
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发表于 2012-4-16 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以选择Alexa Fluor® 647 Annexin V
cuturl('http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-annexin-v-5276.html')
这是FL4的，跟PI之间没有重叠，不需要调节补偿。
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发表于 2012-4-16 16:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

荧光光谱请参见： cuturl('http://www.flowcyto.cn/question.php?qid=203')
和 cuturl('http://www.flowcyto.cn/question.php?qid=208')
PerCP虽然是红色，但是跟PI还是可以通过补偿区分的，只是补偿调节有点麻烦。
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发表于 2012-4-16 16:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对你这个问题比较奇怪。
现在一般的流式都可以做三色荧光了呀，怎么会只有488了呀，应该还可以APC (Allophycocyanin)， 630nm这个通道呀。建议你问清楚些。
最好不要两个通道相重，补偿调整麻烦，结果也不太好分析
这有两个比较少用的，你问问看流式有没有

cuturl('http://www.ebioscience.com/ebioscience/specs/antibody_88/88-8007.htm')
cuturl('http://www.biolegend.com/pacific-blue-annexin-v-5476.html')
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发表于 2012-4-16 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

额，非常感谢版主提供的信息。因为开始说了，FCM只有488nm激光管，所以能选择范围比较窄。版主提到的Alexa Fluor® 647 Annexin V是650nm激发的，在该FCM上做不了，而且因为发射光无法用肉眼看出而不能用荧光显微镜观察。另外，查了一下，相应的Alexa Fluor® 488 Annexin V也是发绿光的，看来Alexa Fluor-Annexin V系列用不了哇，呵呵。
PerCP标记的ANNEXIN V，貌似没有卖的。
今天打了电话问了几处有流式细胞仪的单位的老师，貌似都无法解决这个问题，因为都是激光管有限的。
为了解决这个问题，翻了很多书，打了很多电话，耗了很多天在选染料的问题上，抓狂ing....
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发表于 2012-4-16 16:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以用Annexin V-PE/7-ADD试剂盒
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发表于 2012-4-16 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

额，7-AAD是546激发的，我的FCM仍然用不了
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发表于 2012-4-16 16:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你这个什么型号的流式细胞仪？怎么会只有一根激光管？
常用的BD FACS CAlibur常规配置两根的。
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bluelake[使用道具]
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 小中大

BD的，说是原来配有335nm紫外线激发和现在的这个488的，但是前者两年前坏了，然后就一直没用那个了，只有488
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发表于 2012-4-16 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
BD的，说是原来配有335nm紫外线激发和现在的这个488的，但是前者两年前坏了，然后就一直没用那个了，只有488

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BD FACS CAlibur
一般好像会配APC的检测波长呀.
不会说几处有流式的机子都不配这个波长的呀,
我接触到许多地方的BD FACS CAlibur,基本上都是三色荧光呀,很少有只有二色的.
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