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标题:[求助]转染细胞的选择

ero11[使用道具]
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发表于 2012-4-17 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]转染细胞的选择



已经构建出了真核表达载体，经测序证明正确。
构建载体前为了省钱，问同学要了细胞株HepG2，经RT-PCR检测，无待测基因的表达；上个月刚从上海细胞库购买了HepG2，好像两个细胞的长相不太相同，再经RT-PCR检测，居然是强表达。
又把实验室的有的10多种细胞株全部都检测了一遍，晕倒，都有待测基因的表达。
备注说明：之前做过该基因的表达检测，RT-PCR发现该基因在正常组织、肿瘤组织中都有表达，经Taqman探针定量分析，肿瘤组织的表达量高于癌旁组织，正常组织。
明年就要毕业了，要是还找不到合适的细胞株进行转染，偶咋办啊？！！
大家提提意见，拯救处于水深火热中的我吧！
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-4-17 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但HepG2本来就是肝癌细胞啊。按你的说法肿瘤组织的表达量高于癌旁组织，正常组织。检测出来高表达，不是很正常的事情嘛。至于你的细胞原来没有，后来换细胞有，是不是这两株细胞不太一样。
有没有试过L02细胞，好像是正常肝细胞
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发表于 2012-4-17 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

想请教一下楼上的，正常肝细胞适用于转染吗？要是想做稳定转染，一加上G418，我怕细胞都没了！
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发表于 2012-4-17 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以做稳定转染，选择合适的G418浓度筛选2周。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-4-17 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议：
　　1　找一下你要做的基因的相关文献　尤其是像PNAS　GENES　DEVELOPMENT　NATURE　CELL等。这些杂志　一般都有SUPPLYMENTAL　INFORMATION　好好找一下　应该会找到这个基因在许多细胞株里的表达情况的。
2 细胞株的问题：最好不是从同学那里要来的。因为毕竟我们不知道这种细胞到底传了多少代了，而肿瘤基因组DNA的不稳定性众所周知。所以不同地方养的同一种细胞表达情况出现某基因不同的表达很正常。建议最好选ATCC收录的细胞，最好能从细胞库里买，相对可靠些。
　　你做的不会是microRNA吧　如果是的话我这里倒有些资料（SOURCE）可以与你分享
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发表于 2012-4-17 13:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上各位兄弟姐妹的建议。
我做的基因比较新，国外目前只有三篇文献，国内目前只有我们课题组在做，因此没有相关文献借鉴。
课题组准备做基因的功能学实验，我主要负责将该基因转染入细胞，我的师弟负责将将基因干扰后转入细胞进行研究分析。我一直郁闷找不到合适的细胞。
大家看看我的思路行否？
转染前尽管RT-PCR、western blot检测都表达，转染后挑稳定转染的克隆，再行RT-PCR、western blot做半定量检测，若转染后表达增强，能否进行下游的实验呢？比如说细胞周期、凋亡、迁移等等。
还望大家多指教，小女子在此先谢过了！
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发表于 2012-4-17 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得做成overexpression stable lines，加上你师弟做好的knockdown stable lines，然后进行下游研究是可以的。
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发表于 2012-4-17 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

基因新是一个好处，但其功能重要也不能忽视！
简单来说，研究某基因的功能不外乎通过获得（如over expression）及缺失（如knock-down）两种方式来验证其相关生物学功能（如增殖，迁移，成瘤性等方面）或相关机制（比如信号通路或细胞周期等）
stable transfection cell lines 具有代表性，但应该多挑几个克隆（想发好一点的文章至少要7　8个以上经过筛选才行），或用混合克隆来做相关信号通路会更具有代表性。
实验可行性没问题的。一已之见　仅供参考
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ero11[使用道具]
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发表于 2012-4-17 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做over expression实验对转染的细胞有什么具体要求吗？
是否要求被转染细胞不表达目的基因呢？有弱表达的可以做吗？
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发表于 2012-4-17 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
overexpression没有什么特别的要求吧，只要你转染后做WB，目的蛋白有较为明显的增加就可以证明了。至于是否对你的下游研究有意义，诸如cell lifespan, migration, senescence之类的,那就看你的运气啦,有和预期相符的变化就值得往下做。
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