[求助]流式测细胞周期为什么只出现单个峰？

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标题:[求助]流式测细胞周期为什么只出现单个峰？

mamamiya[使用道具]
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发表于 2012-4-17 18:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小女子刚开始接触流式细胞，做好细胞各期同步化后用PI单染测量细胞各周期百分数，可出来的结果都只有一个峰，看样子应该是G0/G1期。随后的S，G2/M均很少，特别是G2/M几乎没有出现，每个样本都是如此。不知道是哪步实验出错了。还望大侠们指教
我用的是联科生物的试剂盒，就只有一瓶染液
步骤如下：
收集细胞，离心去上清，轻拍管子使重悬，加1ML PBS
将所有液体转移至4ML-20度乙醇中，以最大速度漩涡震荡，-20度放置5-15分钟
离心去上清，加5MLPBS,细胞补水15分钟
离心去上清，加1ML DNA staining solution 室温避光孵育30分钟，送流式

染液保存在4度冰箱，不知里面是否含RNA酶，含RNA酶可放于4度吗？

感谢大家赐教

loli[使用道具]
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发表于 2012-4-17 18:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如何的同步化？首先确认你的细胞已经从G0/G1期出来了，其次G2 S期的细胞本来就比G1的要少，你可以加个G2期阻滞的化合物做个对照，如果有必要的话。
其次单染需要乙醇固定的时间长些，起码2小时以上，过夜也没问题。再摸下条件吧。

cocacola[使用道具]
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发表于 2012-4-17 18:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、乙醇不能用纯乙醇，需要70％的乙醇。
2、乙醇固定时间为30分钟以上。
其它问题不是很大。
我之前总结过两个方法： cuturl('http://www.flowcyto.cn/question.php?qid=207')

hold住[使用道具]
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发表于 2012-4-17 18:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如何的同步化？首先确认你的细胞已经从G0/G1期出来了，其次G2 S期的细胞本来就比G1的要少，你可以加个G2期阻滞的化合物做个对照，如果有必要的话。
其次单染需要乙醇固定的时间长些，起码2小时以上，过夜也没问题。再摸下条件吧。

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谢谢，我用的是同步化试剂盒，可同步在G0,G1,M,G2,S各期，我是拿PI单染测下这个试剂盒的效率的，可是做出来的图都一样，而且空白对照也只有一个峰，所以感觉是出问题了

hold住[使用道具]
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发表于 2012-4-17 18:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、乙醇不能用纯乙醇，需要70％的乙醇。
2、乙醇固定时间为30分钟以上。
其它问题不是很大。
我之前总结过两个方法： cuturl('http://www.flowcyto.cn/question.php?qid=207')

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我加过1ML PBS后乙醇的终浓度为80%，浓度可能差不多，时间是少了点，谢谢啦。会不会是流式机器没调好的原因？我看那个实验员也不太懂。

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发表于 2012-4-17 18:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我加过1ML PBS后乙醇的终浓度为80%，浓度可能差不多，时间是少了点，谢谢啦。会不会是流式机器没调好的原因？我看那个实验员也不太懂。

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浓度差不多？实验上的因素差一点，结果就差很多了。
当然，是不是流式机器的问题还说不好，你最好把图片或相关参数放上来。

hold住[使用道具]
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发表于 2012-4-17 18:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

浓度差不多？实验上的因素差一点，结果就差很多了。
当然，是不是流式机器的问题还说不好，你最好把图片或相关参数放上来。

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她给我的结果，我觉得弄得很不专业，流式细胞仪是其他实验室的，他们专人测，那个测的人是新手。图在附件，我截图的

附件

2012-4-17 18:52

47881952.png (9.59 KB)

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发表于 2012-4-17 18:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我要看的不是这种直方图，而是需要双坐标的点图，横坐标FL2-A，纵坐标FL2-W，从这个点图才能看出标本质量和取的时候有没有调整好。
分析细胞周期最好是用MODFIT软件，这个软件可以自动拟合各个周期的曲线，相对来说更准确点。

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发表于 2012-4-17 18:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我要看的不是这种直方图，而是需要双坐标的点图，横坐标FL2-A，纵坐标FL2-W，从这个点图才能看出标本质量和取的时候有没有调整好。
分析细胞周期最好是用MODFIT软件，这个软件可以自动拟合各个周期的曲线，相对来说更准确点。

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我按你的要求自己用软件搞的，软件为winmid，只有那个免费，我是刚学的。图如下

附件

2012-4-17 18:53

53958055.png (4.42 KB)

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发表于 2012-4-17 18:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我要看的不是这种直方图，而是需要双坐标的点图，横坐标FL2-A，纵坐标FL2-W，从这个点图才能看出标本质量和取的时候有没有调整好。
分析细胞周期最好是用MODFIT软件，这个软件可以自动拟合各个周期的曲线，相对来说更准确点。

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图都差不多，我就贴两个吧

附件

2012-4-17 18:53

62947229.png (5.4 KB)

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