[求助]冻干粉试剂溶液配制分装问题

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标题:[求助]冻干粉试剂溶液配制分装问题

dog002[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

因为实验需要，我购买了LPA干粉试剂（1mg），说明书建议采用PBS（PH=7.2）+0.1%（w/v）的BSA配制，然后-20℃冰箱保存。
LPA分子量为436.5
实验浓度为5μM-50μM（我想这个应该是终浓度比较理想）
现在我要把这1mg配制成溶液分装保存，现不知道要配置成什么浓度分装冻存（自己算了一下，如果用0.5mM，大约是0.27mg/ml，那我只能分装4个EP管，每次用还要反复稀释冻融）
故请问战友们有没有冻干粉试剂配制分装经验可以参考？不胜感激！！

jkobn[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你直接配成你所需的实验浓度就行了

dog002[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你直接配成你所需的实验浓度就行了

————————————————————————————————————————————————————————————————

谢谢提醒！
======
因为我的实验浓度是有一个梯度的，就是5μM-50μM，那么我是不是可以直接配成50μM保存，用的时候如果需要10μM、25μM，适当稀释就行了。
======
但是，这样的话我加入的药物初始浓度，终浓度就不是变了吗？比如，我要加入的培养皿里的液体量是100μl，那么我再加入100μl的50μM的药物后，终浓度不是就变成了25μM了？是不是把1mg的冻干粉试剂配成100μM在分装保存更合适？！

TNT[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于楼主的问题我想这样回答
1、首先应该配制一个储备母液
2、然后配制一个子液

3、根据需要，用子夜去配制工作液，实际上就是用子夜的量来调节，因为你的细胞体系体积应该是确定的，比如六孔板两毫升左右，那么你根据终浓度来确定要加物质的量，然后根据子夜的浓度来确定子夜所需要的体积

所以楼主的问题实际是一个算术问题

希望你尽早解决这个问题

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上是正解。简言之，以我们的经验（但没有使用过LPA），首先要配置较高浓度的储备液，分装保存。如果确定将来使用的最高浓度不超过50uM，0.5mM的储备浓度还是可取的（如溶剂是DMEM等细胞毒性试剂，还要另作别论）。使用时，以储备液，用培养液（而非PBS）稀释成50uM，再用50uM稀释成其他浓度较为适宜。总量4mL，不一定就是分装4管啊，比如可以0.6mL甚或0.2mL一管。另外，一般来说，冻融两三次是允许的。

供您参考~

dog002[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #5 园丁## 的帖子

我计算如下：
1.冻干粉1mg用PH值为7.2的PBS融解，根据0.1%（w/v）的质量体积分数加入定量BSA
2.因为我工作液最大浓度是50μM，又因为到时培养皿中细胞悬液量为100μl，那么，我需要的分装后的储存液可以设定为100μM =0.1mM =0.1mmol/L，到时候最大浓度组即50μM组在细胞悬液中再加入100μl的工作液，总量为200μl，即稀释1倍，得终浓度为50μM。依次类推，如下浓度梯度（25μM、20μM、15μM、10μM、5μM）应该配制的工作液是：
--终浓度--药物----稀释用PBS---定量细胞悬液--稀释倍数---
50μM： 100μlLPA + 0μlPBS +100μl细胞悬液【稀释至2倍】
25μM： 50μlLPA +50μlPBS +100μl细胞悬液【稀释至4倍】
20μM： 40μlLPA +60μlPBS +100μl细胞悬液【稀释至5倍】
15μM： 30μlLPA +70μlPBS +100μl细胞悬液【稀释至6.7倍】
10μM： 20μlLPA +80μlPBS +100μl细胞悬液【稀释至10倍】
5μM： 10μlLPA +90μlPBS +100μl细胞悬液【稀释至20倍】
3.根据质量1mg和分子量436.5g/mol，得出0.1mmol/L即0.1mM即100μM（储存液浓度）需要加入的PBS量为22.91ml【体积=[1mg÷（436.5g/mol）]÷0.1mmol/L=22.909507ml】
4.那么，我需要分装23个EP管，22个EP管分别装1ml，最后1个装910μl
===================================
在此我再请教一下，有没有分装这么多的或者这个分装方法是否可行？还有，在加药稀释时用PBS好还是用培养液好？

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

计算没有问题，分装23个EP管也没有问题。问题是药液稀释：

储存液配置100uM，如你计算的那样，50uM工作液中PBS量占到50%，这么多的PBS会不会对细胞生长有影响？储存液浓度越高越可以降低或排除溶剂对细胞生长的影响。否则有人会在这方面提出疑问的。稀释液要用培养液也是这个道理啊，因为对照组的细胞是纯培养液。

100uL的体积应该是用96孔培养板吧，一般而言每组应该设三个复孔。也就是说每组需要准备超过300uL的工作液才够。如果后期需要做Western等实验，96孔板肯定是不够用的。

dog002[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 园丁## 于 2012-4-18 12:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

计算没有问题，分装23个EP管也没有问题。问题是药液稀释：

储存液配置100uM，如你计算的那样，50uM工作液中PBS量占到50%，这么多的PBS会不会对细胞生长有影响？储存液浓度越高越可以降低或排除溶剂对细胞生长的影响。否则有人 ...

感谢版主回复，那么我要用培养液替代PBS了。
此外，之所以分装23个EP管，我就是怕反复冻融影响药物活性。
我做的是24孔板的transwell，孔板加600μl，小室内加100μl细胞悬液+药物100μl。
后期是要做western，但是我会改用6孔板或者培养瓶，这是另一项实验内容。
最后，对“储存液浓度越高越可以降低或排除溶剂对细胞生长的影响”这句话还不能理解透，根据你的意思，我是不是要设置比100μM更高的储存液浓度为宜？

附上LPA部分说明书：

附件

2012-4-18 12:28

85081701.jpg (77.31 KB)

dog002[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

HOW TO USE:
The bioactivity of LPA seems to require long (i.e. C:16 to C:18) acyl carbon chains of the type usually found associated with membrane lipids 2,6,11,16 although optimum requirements for a single type of acyl carbon chain are not universal. The bioactivity decreases with shorter chain length.11,16 In serum, oleoyl and palmitoyl fatty acid containing LPA are the predominant species.6,9 Other structural requirements have been reviewed.6,8,10 LPA is prepared in an appropriate media, such as described in the solubility section and added to the system under study.
================

附件

2012-4-18 12:28

95187790.jpg (69.83 KB)

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

储存液浓度越高越可以降低或排除溶剂对细胞生长的影响。打个比方吧，工作液浓度为50uM，需要量为1mL，假设药物是用DMSO溶解的：
储存液浓度----储存液需要量（DMSO体积）------DMSO占总体积（1mL）百分比
100uM-------------500uL---------------------------------------------50%
500uM-------------10uL----------------------------------------------1%
1mM---------------1uL-----------------------------------------------0.1%

因此，当工作液浓度一定时，储存液浓度越高，溶剂占细胞培养液总体积的比例越少，对细胞生长的影响也会越少。

“... in PBS pH 7.2 at up to 0.3mM (0.14mg per ml)in the ...”，您用的药粉LPA不易融于DMSO、酒精，在氯仿：甲醇：乙酸=95：5：5的溶剂中溶解性较好（10mg/ml），而在添加0.1% BSA的PBS里溶解度可达到0.3mM。如果最大使用浓度为50uM，还是推荐您配置0.3mM的储存浓度。

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