[求助]做神经细胞原代培养的群友，看看这是什么东西

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标题:[求助]做神经细胞原代培养的群友，看看这是什么东西

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发表于 2012-4-18 12:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位群友，我是用以下方法做的：
1.头天晚上用0.01mg/ml的多赖铺在dish中。每皿加1ml多赖，静置过夜，第二天吸出多赖，放入细胞培养箱中烘干，在最后接种时取出。
3.取一日龄SD鼠，用75%酒精消毒。
4.用剪刀剪下鼠头，从耳后缘处剪起直到眼眶后缘两侧都剪过后，用镊子将其头皮和头盖骨一起掀开，暴露整个脑组织。
5.用镊子整个的取出脑组织，置于加好解剖液的35mm皿中，剥离脑皮层，置于另一加好解剖液的皿中。
6.取3ml胰酶于皿中，放入细胞培养箱里使胰酶温度孵育至37℃（10-15min）
7.等所有新生鼠的海马全部分离出后，再小心剔除脑膜（从红色的血管来判断脑膜是否已剥离），将已剔除脑膜的海马放入另一个盛有解剖液的皿中。
8.使用玻璃注射器芯轻轻研磨脑组织至较小的组织块（约2mm左右，大小不等）。
9.使用滴管轻轻吸出组织，加入到盛有胰酶的皿中消化15min。消化中可以晃动1次，使海马组织可与消化液充分接触。
10.在此15分钟内准备下步工作，取出四个15ml的离心管，其中三个加入3ml种植液，取出三个吸管（一细两粗），等。
11.15分钟后取出，消化理想状态是碎片抱团抽丝。用吸管吸出碎片置盛有种植液的管中进行第一次洗涤，静置3-5min后（理想状态应会沉下去），弃去上清，下层用粗头吸管吸出置另一盛有种植液的管中进行第二次洗涤，静置3-5min，弃上清，下层再用粗头吸管吸出置于第三支盛有种植液的管中，先用粗头吸管轻轻吹打20次左右，再用细头吸管轻轻吹打20次。
12.离心，1000rpm，30秒（从1000转速时开始计时）。
13.（新吸管）取上清置第四支管中，在第三支管中再加2ml左右种植液使沉淀重悬，再用细头吸管轻轻吹打20次左右，离心，1000rpm，30秒（从1000转速时开始计时）。
14.取上清置第四支管中，取出10ul（充分混匀后）含有海马细胞的液体用其他液体（双用种植液）稀释十倍，取10ul稀释液计数（或不用稀释直接计数）。
15.按每皿100万细胞种植。(皿是提前铺好多赖的)。
16.四个小时后全量换饲养液。
17.24小时后半量换neuronbasal。
以前用这个方法做出来过，可是这次4小时候换液发现细胞贴壁的不多，有很多透光性很强的细胞，第2天的时候还是这样，现在已经是第4天了，已经全是这样的东西了，怀疑是不是细胞，请各位给与指点，谢谢啦！

附件

2012-4-18 12:35

59172967.jpg (19.32 KB)

wsll[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

摸条件已经快半年了，至今没有很好的结果，以前做出来过，可是细胞聚集的很厉害，没法进行下一步，以为是胰酶消化的不好，这次换了一家公司的胰酶，含EDTA的，怎么就搞出这样的结果，真是郁闷，请大家多多帮忙啊！
还有以前也见到过这样的东西，感觉只要神经元分的少，它就多。

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发表于 2012-4-18 12:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

发张以前的，请大家参考

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2012-4-18 12:40

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发表于 2012-4-18 12:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.图1中全是死细胞。
2.图2中只有几个神经元，混有很多的胶质细胞，细胞不纯。
建议：使用孕16-18天的胎鼠进行取材。

yes4[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多聚赖氨酸浓度太低了，养神经元怎么也得100ug/ml，你这个10ug/ml不行的。

第一张图中都是死细胞。

第二张图中的细胞状态也不好。

细胞聚集我以前经常碰到，后来发现就是多聚赖氨酸的关系，换了进口的就好了。不过神经元确实比较爱聚团。多聚赖氨酸包被是非常非常重要的！

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发表于 2012-4-18 12:44 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位了，明天重新做一次，看看怎么样。我的多赖是sigma的。

nn255[使用道具]
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发表于 2012-4-18 12:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

摸条件已经快半年了，至今没有很好的结果，以前做出来过，可是细胞聚集的很厉害，没法进行下一步，以为是胰酶消化的不好，这次换了一家公司的胰酶，含EDTA的，怎么就搞出这样的结果，真是郁闷，请大家多多帮忙啊！
还有以前也见到过这样的东西，感觉只要神经元分的少，它就多。

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而且你做原代为什么要用EDTA呢，这个裂解的作用对神经元来说太强了，一般是在传代的时候消化细胞用的，原代神经元一般就用0.125%的胰酶就可以了，可以加一些DNA酶但是不要加EDTA。

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发表于 2012-4-18 12:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上的各位。我现在用0.25%的胰酶（含EDTA）消化30分钟，细胞状态挺好，可以养10天左右。以前细胞死亡的原因可能与培养基的pH值有关，我买的DMEM放了半年多，时间有点长了，pH>8.0，后来换了培养基，细胞状态就挺好的。