小中大实时PCR在慢性乙肝和原因不明的肝功能异常诊治的临床应用
慢性乙肝的治疗近年来取得了突飞猛进的进展，各国对慢性乙肝的治疗目标、治疗终点和疗程都有了更新的认识，在我国HBV -DNA分子诊断指标方面，传统的检测手段面临了新的挑战。上海华山医院感染病科尹有宽
我国最常用的HBV -DNA定量的方法有酶标法和荧光法两种。目前HBV- DNA检测下限也不是ESAL等指南所用的10-12 IU/ml, 而是500或1000 copies/ml，检测范围为3log10至7log10 copies/ml，检测敏感度也不高，一般会有1个对数值的偏差,而且难以准确评价药物疗效、准确监测病毒反弹及耐药情况反映,也难以合理管理耐药。而且目前尚未广泛使用国际单位。
而实时PCR检测方法可解决酶标法和荧光法定量HBV- DNA存在的问题，在临床工作中具有深远的意义。2009 EASL 指南提出慢性乙肝治疗终点问题:持续病毒抑制是慢性乙肝达到其治疗终点和最终治疗目标的基础,抗病毒治疗中的HBV- DNA检测,须将HBV- DNA降至尽可能低的水平, 最好低于实时PCR检测的低限 (10~15 IU/mL)，该技术以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。实时PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。卫生部临检中心最近已要求各单位要统一为IU/ml， 1 IU= 5copies/ml。
实时PCR已经在临床工作中显示了其重要的意义：
⑴：香港临床材料显示，222例初治患者持续3 年接受 0.5 mg ETV，当HBV-DNA小于60 copies/ml时，1年、2年、3年HBeAg 血清转换累积比率分别为22.2%、40.8%和43.9%;
ALT 复常累积比率分别为84.0%、88.0%和 90.4%。
⑵: 意大利临床材料显示, 376例初治患者持续2 年接受 0.5 mg ETV，当HBV-DNA小于60 copies/ml时，38% 的病人于 24 个月内达到 HBeAg 血清转换，.6% (6/376)达到 HBsAg 消失，4 位病人血清转换至 抗-HBs 并停止治疗。
本人在临床工作中也一些工作体会:
病例一，王某，男，68岁。腹胀、右上腹不适半年，曾在宁波传染病医院、浙大一附院就诊，B超及CT提示肝硬化腹水、脾肿大，HBVM示抗HBc阳性， HBV DNA<103 copies/ml，余病毒性肝炎标志检查皆阴性，白细胞2.8*109/L，血小板5.3*109/L ，今年7月来我院就诊，查实时PCR 172 copies/ml，诊断为隐匿性乙肝、肝炎后肝硬化，对症处理并加用ETV治疗,两月后临床症状明显好转，生活自理。
病例二，李某，男，32岁。乏力伴反复肝功能异常在多家医院就诊，HBVM为乙肝三抗体，HBV DNA<103 copies/ml， A/G 37/41 ， B超、CT示肝硬化、脾肿大，予保肝降酶治疗，疗效不佳。今年5月来我院就诊，查实时PCR 383copies/ml，诊断为隐匿性乙肝、肝炎后肝硬化，对症处理加用LAM治疗，自觉临床症状明显好转，9月中旬ALT复常，AST 58 u/L，A/G 42/38 。
病例三，张某，男，33岁。06年1月来我院就诊，HBVM小三阳，HBV DNA 5.2*106/L，ALT 136 u/L，予ETV治疗，半年后HBV DNA<103 copies/ml，每年数次检查HBV DNA皆<103 copies/ml，肝功能一直正常，患者要求停药，今年6月查实时PCR <12IU/ml，尝试停药，9月查实时PCR <12 IU/ml，肝功能正常，能够正常上班。
病例四，周某，男，31岁。1998年2月外院就诊，查HBVM小三阳，HBV DNA 2.2*106/L，ALT 327u/L，予代丁治疗，五个月后HBV DNA<103 /L，肝功能正常，每年数次检查HBV DNA皆<103copies /L，肝功能一直正常，今年5月，患者想停药生育来我院就诊。今年5月查实时PCR <10IU/ml，肝功能正常，11月查实时PCR <10IU/ml，肝功能正常，尝试停药，至2011年1月检查实时PCR，仍然<10IU/ml，肝功能正常。
由此可以看出，实时PCR能够大大降低临床HBV -DNA检测下限，提高监测的精确性,HBV- DNA达到实时PCR检测下限提示患者将获得高e抗原血清学转换;实时PCR有助于临床隐匿性乙型肝炎和肝硬化的诊断;有利于观测是否可停止抗病毒药物治疗或及时发现停药后的病毒学反弹;通过定期检测HBV- DNA及时预测耐药发生情况，对疾病的治疗及评价药物疗效有着重要意义。目前国内实时PCR仅少数单位能做该检查。
