[求助]皮肤角质形成细胞培养

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标题:[求助]皮肤角质形成细胞培养

bohe221[使用道具]
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发表于 2012-4-20 11:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好，本人最近养角质形成细胞，细胞长的一直不太好。请问角质形成细胞除了用角质形成细胞无血清培养基外，含血清的一般可以用什么培养？如果混有成纤维细胞和黑素细胞，可采用什么方法纯化？

owanaka[使用道具]
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发表于 2012-4-20 11:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人原代培养角质形成细胞多年，有一定经验，希望有所帮助。
1 使用含血清培养基的话，必须用NIH3T3细胞做滋养层。培养液的配制、滋养层的制备等等，操作较为复杂，要求熟练技术和丰富经验。而且一旦出现成纤维细胞混杂，几乎无法去除。
２所以最好还是用角质形成细胞专用无血清培养基（Gibco, Sigma都有售, Gibco的K-SFM效果不错）。虽然费用较高，但是细胞生长良好，易于操作。而且该液体本身就不支持成纤维细胞和黑素细胞的生长，培养10d左右就可获得纯化的细胞。

owanaka[使用道具]
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发表于 2012-4-20 11:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

下面是我的protocol，希望有所帮助。

Protocol：
皮肤分离液：dispase，用D-Hanks配制，浓度为2.4U/ml（热消化）；或者为1.2 U/ml（冷消化）；
表皮细胞分离液：0.25%胰酶/0.1%EDTA（1/1）；
培养液：Gibco 的Keratinocyte-SFM。

Ⅰ 取新生儿或青少年（最好在10岁以内）包皮环切术后包皮组织，为保证无菌，处理前在75%乙醇中浸泡1min；
Ⅱ 将包皮组织转入培养皿中，用加入抗生素的PBS清洗，用眼科剪和眼科镊修剪，尽量去除皮下组织，用锋利11号手术刀片将组织分切为2mm×10mm；
Ⅲ 取4块组织放入15ml离心管中，加入4ml皮肤分离液（1ml/块皮肤），37℃，2.5h；如果用冷消化（推荐使用），则用PBS将上述分离液稀释一半，加入4ml（1ml/块皮肤），4℃，消化过夜（约15h）；
Ⅳ 将消化后的皮肤倒入培养皿中，用眼科镊（一直一弯）将表皮和真皮仔细分离（必须极为小心，避免把真皮组织带入表皮组织中）；
Ⅴ 将分离的表皮放入离心管中，加入4ml表皮细胞分离液，37℃，消化10min；用含血清的培养液终止消化，用吸管反复吹打以获得单细胞悬液，过200目筛网以去除剩余残渣，收集滤液，离心去除消化液，用PBS清洗1次，用Keratinocyte-SFM重悬接种。

附件

2012-4-20 11:57

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bohe221[使用道具]
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发表于 2012-4-20 11:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢您的帮助，您的细胞养的真漂亮！因为初次接触细胞培养，而且实验室也是刚成立不久，设备不齐全。因为基础很差而且实验室没人指导，所以导师让我先用胰酶消化分离真表皮，1640培养液养角质形成细胞，我一直没有查到关于1640培养角质形成细胞的资料，但导师说1640可以，我尝试了好几次，细胞最初几天还可以，导师看了说有生长的比较好的细胞（混杂成纤维细胞和黑素细胞），但一周后，细胞基本不怎么长，而且原来生长的细胞也飘起来了，培养瓶里的细胞也很杂乱。好郁闷！我也问过一个以前养过角质形成细胞的老师，她也用的dispase和K-SFM，她说1640不能用于养角质形成细胞，不知道您有没有试过用1640养？非常期待您的经验！
再次感谢您的帮助！

qqq111[使用道具]
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发表于 2012-4-20 11:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你导师的细胞培养知识实在有限。
1640等普通培养基是不可能培养角质形成细胞的。
没有dispase，用胰酶分离表皮也可以，当然效果远不如前者，这个是我专门做过实验比较的。
多向养过KC的那位老师请教吧。最好请她带你做一次，这个细胞难度很大，不过一旦掌握正确方法，细胞还是很强壮的。
祝好运。

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-4-20 11:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

向群友请教：如果人的原代细胞不容易得到，是否可以用新生小鼠的皮肤？应该取哪个部位的好些呢？
还有就是原代培养本身就比较困难，加上角质形成细胞不好培养，是否有哪种具有肿瘤细胞特性的角质形成细胞株可以直接用来传代培养的？谢谢

abc816[使用道具]
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发表于 2012-4-20 11:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #6 utt0989 的帖子

小鼠角质形成细胞的培养是世界难题，难度比人的细胞大的多. 能传1-2代就算不错啦.
细胞的分离和人的差不多，就是没有合适的培养基.
应该有正常的角质形成细胞系. 肿瘤细胞和正常细胞差别是很大的，个人意见为否.

xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-4-20 12:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问，我最近在养小鼠的,遇到很多困难，想请教，你所说的GIBCO无血清用于小鼠是否合适？我在养的过程中发现，分离后获得的细胞绝大多数会死去，在人的也会有这种现象吗？我想死去的是否是已分化的角质细胞，无法在无血清中存活。在你的培养过程中，死去的细胞大概百分比有多少？
另外，为什么小鼠的比人的还难养。
谢谢，希望群友能指教。

summerxx[使用道具]
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发表于 2012-4-20 12:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 无血清培养液的特点是专液专用，这是它最大的优点同时也可以说是最大的缺点，就是说用于人的K-SFM是不适于老鼠的。
2 角质形成细胞（或角朊细胞）对于钙离子的要求很高，人和老鼠细胞的要求是不一样的，而且应该还有其他方面的差异。日本学者在这方面研究较多，可以查一下。目前来看，人的KC比较成熟，可能的话还是养人的细胞吧。最好是包皮，年龄越小越好。
3 消化法分离细胞本身就会导致大量细胞死亡，此外正如你所言，KC分离时由于有分化的KC，所以死细胞更多，个人经验显示，分离后细胞90%以上都是死细胞。所以最好第二天换液。

bohe221[使用道具]
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发表于 2012-4-20 12:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢回复，无奈。我必须用小鼠的，继续摸索吧。附上一篇文献，对我的帮助很大，希望对其他人也有用。
另外请教，角质细胞传代时需要注意什么。我辛辛苦苦养起来的细胞传代时用TYPSIN消化，如战友所言，很难消化，在显微镜下看着细胞变园，脱落，然后中止，结果你猜怎样，细胞不贴壁了，下次我是否换DISPACE.或者不等全消化下来就中止？

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