细胞世界

你的冻存步骤有问题。

应为： +4度 20-30min
-20度 30min
-80度 过夜
转入液氮

注意：-20度不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡。（引自南京凯基公司资料！）

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这边他们实验室也都是 -20度，2小时，-80度过夜，都没问题。还有直接放入-80度的，复苏的细胞也都可以。网上也有说 -20度 ，2个小时的。

从你所描述的情况来看，建议你从以下三方面查找原因：
1、冻存前的消化过程：杂交瘤细胞为半贴壁细胞，有可能你的消化程度没有掌握好，致使消化过度。
2、收集细胞的离心操作：细胞消化后进行离心，以收集细胞，如果离心速度太大对细胞也会损伤有加，一般要求离心速度是不大于1000rpm，时间不多于5min，温度是室温。
3、冻存过程：该过程是个逐渐降温的过程，不能降温太急剧，一般是4度放置20min，-20度放置不超过30min（最好不要超过30min），然后放入超低温冰箱或液氮中保存。你的细胞在-20度放置的时间太长了。
4、复苏过程：与冻存过程相比，复苏过程要求尽量短时间内完成操作，从超低温冰箱取出冻存管直接在37度水浴溶解，一边摇动帮助溶解。

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我离心是 1000rpm, 10min 。

复苏的是否尝试不离心直接加培养基培养,等部分贴壁以后换培养基.我的杂交瘤复苏的时候存在同样问题,但是不离心第二天换培养基就活得很好.

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我都没有离心，细胞溶化后，直接加的培养基！ 前文说的离心，是冻存时候的离心。