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标题:[求助]原代细胞分离出现组织粘稠，细胞消化不下来...

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发表于 2012-4-21 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]原代细胞分离出现组织粘稠，细胞消化不下来...



小生正在做宫颈癌原代细胞三维立体培养，需要组织分离出来的分散的细胞（实验要求计数达到10的5次方个），用Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶37℃温箱消化后，组织呈粘稠状，上清液内几乎看不到消化下来的细胞，而粘稠的组织中可见大量细胞，细胞被粘连在组织中下不来。
请有经验的前辈给予指点，小生不胜感激！
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-4-21 14:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

据我的经验因该是组织块剪的太碎
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-4-21 14:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
组织在剪碎和消化过程中被破坏的大量的细胞释放出来的genome，具有粘性。可以加入DNase,或者在剪的时候不要太碎
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发表于 2012-4-21 14:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用的是胶原酶1，刚开始的时候剪的不太碎，但是消化3个小时都没有消化下来，后来就是听他们说剪的不够小，总之就是没有消化出单个的细胞。
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ha111[使用道具]
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发表于 2012-4-21 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
DNase是那种类型的，哪个公司的，怎么用，这边养细胞的都没有用过，查资料上有用的，但是好几种类型不知道该选哪种,还望赐教。
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-4-21 14:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胰酶消化后要吹散才可以得到分散的细胞的
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-4-21 14:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上清液内几乎看不到消化下来的细胞，而粘稠的组织中可见大量细胞，

————————————————————————————————————————————————————————————————

肉眼怎么可能看到一个个的细胞啊，能看到的肯定已经是组织了。
你所要做的就是把看不到细胞的上清液吸出来，终止消化后离心，看看有没有沉淀，有时候细胞量少的话，沉淀你也看不见，非得在显微镜下才能够看见。

good luck！
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发表于 2012-4-21 14:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢上面同道好友的解答，
补充一点观察时是在显微镜下

前两天刚做了一例，取了宫颈癌活检组织（取材和无菌应该没有问题），用Ⅰ型胶原酶37度消化1.5小时，胰酶接着消化30分，中间隔15分钟震荡一次，镜下上清中仍没有所需细胞，但可见好的小小的细胞，怀疑是血细胞（组织中残留的少量血），好几天都不贴壁，一直漂着。而组织被消化的成一团清亮的粘稠状，像稠胶水。接种在瓶内仍没有贴壁细胞，仅见许多疑似血细胞的亮点。

是否还有其他的可行方法将细胞从宫颈癌组织中分离出来，请这方面有经验的高手给指点一下，将不胜感激！
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-4-21 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也感觉是破碎细胞释放的核酸以及损伤组织释放的粘蛋白之类造成的，组织块剪切后用含5%血清的培养基洗2，3遍再加酶消化。
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发表于 2012-4-21 14:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你消化的体系不完善
干脆组织爬片吧，如果是肿瘤的话，爬出来长的很快的，其他的一些成纤维细胞长几代就不长了。
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