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标题:[求助]养细胞两个月，三次细菌污染，是不是我这人有问题？

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发表于 2012-4-24 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]养细胞两个月，三次细菌污染，是不是我这人有问题？



我真的要疯掉了，被打败了
第一次是原代长大十几天的一皿和原代3天的一皿
不知道为什么，前一天晚上还像个样子，准备传代的，第二天就全污染了
然后继续用原来的培养基，继续取材
这里说下，我养的是大鼠的MSC细胞，听说是非常好养的一种
后面我就每个星期取一只，细胞也长起来了，也传代了
传到P3代，准备开始流式分选了，就在准备做的前一天晚上
细胞又污染了
而且是所有的细胞，一共有十皿，有P0--P2代的，我也没给它们集体换过液
每只老鼠的都是分开放的，搞不清楚怎么就突然都细菌污染了

我的培养基都是买的袋装的，自己配，配好了抽滤
培养基也做了无菌试验，结果也是好的

我坚持，继续，昨天我又取了一只老鼠，昨天离心完感觉沉淀还很多，心里感觉还不错
今天去看，又黄了，明显的细菌污染
镜下可以看到一层的小黑虫在里面晃，那场面真是难受

我就是想不明白了，污染在我这里也太常见了，是不是我个人有问题啊？
有人帮我分析一下吧
先在这里谢过各位了
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2012-4-24 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

详细说下我的实验流程：

首先是把装培养基的新瓶子洗涤，泡酸，再高温高压消毒灭菌。我用的都是一种蓝盖的广口瓶

培养基是GIBCO公司的进口的IMDM粉末，用三蒸水溶解，加碳酸氢钠调PH值到7.0-7.2
用专门的滤器抽滤
滤器是经高温高压消毒的，加上0.22的微孔滤膜
然后进细胞房抽滤，抽滤好的基培做无菌试验，结果培养基颜色还是清亮的，没有沉淀，没有杂质
完培在用之前配的，用的是进口的HYCLONE 的胎牛血清，配完后做无菌试验，结果也是好的。这里做无菌试验都很简单，就是把培养基用枪吸到个5ML离心管中，放细胞专用的培养箱的，2天后观察

看我的细胞感觉最大问题就是培养基，但是无菌试验也做了，我就不明白了
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2012-4-24 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

然后谈取材：
大鼠脱颈处死，放75％酒精里泡个3分钟
然后就先剥皮，再分离骨头，把骨头上的肉尽量去除
把股骨和胫骨取出来，放解剖液里。这里用的解剖液就是基培加上抗生素
抗生素用的是青霉素和链霉素

然后进超净台，把骨头上的肉剔干净，把骨头两端去掉，有一端是把关节拧开的，另外一端是剪刀剪开的。进超净台以后的器械都是干净的，和取骨头时用的是分开的

然后就是用5ML一次性注射器，用IMDM基培把骨髓冲出来。我一开始用的是加了双抗的基培，后来觉得加了对细胞生长不好，就改用不加的了

骨髓冲出来后，放入5ML离心管中，1000RM离心5MIN
取沉淀，用加了血清的IMDM重悬，种到一个大皿里

这样取材就结束啦

不知道是不是取材有问题，因为我养的细胞状态一直不好，原代要长10天才能传代
传代后的细胞活力也不好，有拉网现象。
但是我也有两只老鼠的细胞长的传到了P3代，传代后3天就能长满的
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发表于 2012-4-24 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
污染最大的可能来源于血清,营养太高,无抗生素,多次取用,非常容易污染.
其次是培养基,如果不加抗生素,对操作技术要求很高,
双抗对细胞的抑制作用不明显,还是可以加的,能对抗轻微的细菌污染.

如果你不同期换液的培养物,同一个时间污染(同时变黄)
是不是考虑培养箱内空气严重污染.
其他人的细胞会不会污染.
如果细胞对PH要求不高,试试密闭培养瓶,会不会被污染.

我以前到一个实验室做一段时间的细胞培养(杂交瘤).
他们实验室如果有一个人的东西污染就把温箱给消毒一遍.
所有人的东西都要处理一遍.

还有你的超净台,是不是空气过滤功能有问题,吹进去的风里大量含菌,
和你共用一个超净的人,他们有污染么?

污染肯定是有原因的,把所有的操作,从头到尾考查一遍,总会有收获的.

建议一次配大量基础培养基(含双抗),分装后放-30度冷冻.
血清也分装冷冻.
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发表于 2012-4-24 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你看看培养箱中的水，看水污染了吗？可能需要重新清洗培养箱
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 小中大
谢谢你们啊
至少还有人关心我
整个细胞房就我一个人在污染，我都快被驱逐啦

所以还是考虑自己操作的原因
准备明天再取一次看看，重新配完培
冲骨髓的时候还是加双抗
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发表于 2012-4-24 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

又想到一个问题，你们取材的时候把骨头从老鼠身上剪下来之前把肉剔的很干净吗？
我发现如果把肉剔很干净很容易把骨头损伤
骨头上面像是有骨髓渗出来

其实我更喜欢肉带的多一点放解剖液里再进超净台去肉

有经验的来谈谈吧，到底哪种方法比较好啊？
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-4-24 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接在超净台取骨头啊！老鼠泡过酒精，入超净台操作，没问题的。倒是像你那样，问题还大点
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2012-4-24 16:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
直接在超净台取骨头啊！老鼠泡过酒精，入超净台操作，没问题的。倒是像你那样，问题还大点

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但是我们这里其它人取都是在超净台外面的
怕老鼠身上病菌太多，会污染超净台

不过照你那么说，还是肉稍微留多点比较好吗？
至少骨头还没有暴露在外界环境呢
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 小中大

我觉得培养原代细胞最好是加上双抗，虽然对细胞有一定影响，但污染程度会大大降低~~
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