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霉菌污染
表现:真菌的种类很多,污染的多是曲霉菌,白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物,一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不变混浊。倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状,树枝状或管状菌丝,并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形,散在细胞上及细胞周边生长。有时通过显微镜可能会发现在培养瓶外壁生长的菌丝,较易误认为污染。发现瓶外的菌丝后应及时用酒精擦拭干净。
处理:首先,需确定污染物是细菌、真菌、支原体,还是酵母。现在你确认是霉菌污染。因此,尽快把污染细胞与其它细胞系隔离开,同时需要对实验过程中所用的器材和试剂做处理。
一般来说,高浓度的抗生素和抗霉菌素都可能对细胞或细胞系有毒性作用,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。
下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染