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标题:[求助]细胞培养中被一幽灵困扰数月

tangxin_80[使用道具]
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[求助]细胞培养中被一幽灵困扰数月



肝癌细胞株:HEPG2;培养基:DMEM(H) 12—15%小牛血清; 培养环境:37℃ 5%CO2
培养细胞几个月了,一直不顺利,特别是这株细胞,前后养了3次都出现同样的问题;真的就像被幽灵缠住了一样,小弟现在是寝食难安,望大家帮忙看看,指点迷津。
具体情况:细胞复苏后密度较高,帖壁迅速,生长良好,两天基本能长满瓶底,传代一次后生长速度略慢,仔细观察细胞间有少数细小颗粒,再次传代后小颗粒明显增多,细胞生长速度明显变慢,细胞形态开始失常,3-5天也难以长满瓶底。再往下传代,细胞密度下降,小颗粒急剧增加,常迅速铺满瓶底,圆形或类圆形,分布均匀,高倍镜下观察偶可看到少数颗粒有不规则运动,消化时和细胞同时脱落,帖壁比细胞更早,传代细胞密度大时细胞还能缓慢生长,密度低时细胞生长基本停止,有时几天都没什么生长;(似乎被小颗粒占据的地方细胞就无法生长)
但是培养基从来不浑浊,培基消耗速度稍快(相对于细胞生长情况),细胞也不会很快死亡,两者可以共生很长时间。实验室老师也说不清是什么。(见图)
第一瓶

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20X(同一视野焦距微调)


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8
 
补充一下:一共尝试培养了三次,每次都是重新从细胞库购买复苏好的细胞;第一次出现问题丢弃了所有的试剂,更换培养箱,第二次,用12孔板培养所有的试剂没有发现问题,而且同时培养的Huh-7没有异常。
问题:是不是污染?是什么污染?问题最可能出在什么地方?有什么可行的办法?还望各位前辈不吝赐教,小弟这里先***了,只希望被老板宰掉了之前能弄个明白,也就能瞑目而逝,含笑九泉了
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400X第二瓶,好眼熟啊,唉不知道什么鬼东西!不像细菌动的明显,不认真看还以为是杂质呢,有些会动,增殖不快,贴壁,我都污染好几次了,没办法呀,DXY的高手快出来救人啊!
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junjie05[使用道具]
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霉菌污染
表现:真菌的种类很多,污染的多是曲霉菌,白色念珠菌,酵母菌,黑霉菌,孢子菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成淡黄色或是白色的漂浮物,一般肉眼可见,较易被发现,短期内培养液多不变混浊。倒置显微镜下可以看见细胞之间有纵横交错穿行的丝状,树枝状或管状菌丝,并漂浮在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可以看见链状排列的菌株。念珠菌及酵母菌菌株呈卵圆形,散在细胞上及细胞周边生长。有时通过显微镜可能会发现在培养瓶外壁生长的菌丝,较易误认为污染。发现瓶外的菌丝后应及时用酒精擦拭干净。
处理:首先,需确定污染物是细菌、真菌、支原体,还是酵母。现在你确认是霉菌污染。因此,尽快把污染细胞与其它细胞系隔离开,同时需要对实验过程中所用的器材和试剂做处理。
一般来说,高浓度的抗生素和抗霉菌素都可能对细胞或细胞系有毒性作用,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。
下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染
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