[求助]做CCK-8时几个小疑问，请高手帮忙解答一下

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标题:[求助]做CCK-8时几个小疑问，请高手帮忙解答一下

wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我刚开始做实验，都不是很熟练，遇到几个问题，请大家帮忙看一下，先谢过了：

1.每次加药就10ul，感觉就一点点，手抖得厉害，一不小心就挂在壁上了。请问有什么方法可以帮我一下吗？

2.因为操作不熟练，所以加药的时间特别长，不知道对最后的测量值有没有影响。

3.说明书上写OD值在1-2之间比较可靠，请问这在实际中是不是对各种细胞都是适用的。

非常感谢！

乌贼老弟[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，拿水和废板子练一下手，10微升还是很多的，我们还要1ul加药呢。挂到壁上可以轻轻拍拍，晃一下，不过不要晃出来了。加的时候不要加入气泡。
2，影响应该有，但是不至于太大，加完放到37度开始脱氢酶的反映才会很快。一般一个板子5分钟以内加完就好了。最好不要长过10分钟。
3，各种细胞都适用，实际每种细胞最好摸一下种板密度（5000-10000/96板孔）。读数大小和cc-8反映时间成正比，有的细胞加入进去1小时就值很高了，有的需要4个小时甚至更长时间。具体视实际情况。一般在1.2-1.5比较好。在0.9-2之间都还可以吧。因为空白培养基都可能0.2-0.3之间。

非高手，用cck-8也不久，初级者回答初级者的问题也许更详细，希望对你有用。这个cck-8我也刚刚用了几个月，很快你就熟了。

wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢！说实话，我前面做的这个试验挺惨烈的。加CCK加到一半枪还坏了！郁闷死人！我们开始做的是5000，结果出来的IC50根本不行，于是做1000和2000，加上我的笨鸟技术，孔里基本上就没剩下几个细胞了。。。。。。

多谢回答，我再勤加练习吧！谢谢！：）

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问一下，您的细胞是贴壁细胞还是悬浮细胞啊，悬浮细胞一般多长时间测比较合适啊？我第一次做这个，谢谢你

plaa[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也是第一次做，遇到了和楼主一样的问题
我的OD值普遍在1.5-2.5之间，有时还到3.0多，密度摸了几次好像都差不多，我现在种的是5000/well,是悬浮细胞，但结果很糟糕~
还有就是CCK-8真的好贵哦，一枪下去2元钱呢 ~~~~~~
郁闷
请各位大侠指导

plaa[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问做CCK8是一定要用490nm的波长吗？
我么实验室是590的，而且我不知道怎么调啊？
谢谢哦

wmp1234[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

CCK-8要用450的波长啊，说明书上写得很清楚啊，同时参比波长要设到600或以上。seaky_2001910，你不要告诉大家你做CCK-8都是用490测的。。。。。。

说明书上还讲OD值在1-2之间是最好的，超过2可能大了些，也许是你培养的时间太长了吧。我种的是PANC-1，摸了好几次觉得4000的最好，不过结果还没给老板看，等他看了再说吧。是挺贵的，我第一次没有细胞还加了结果被老板训了一顿，郁闷了一晚上。

qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我前几天做了一下，结果不太好，有几个问题想问一下：
1、说明书上：I do not have a 450 nm filter. What other filters
can I use? You can use filters with the absorbance between 450
and 490 nm, even though 450 nm filter gives the best
sensitivity.我们实验室没有450NM，我只能用490的，郁闷哪。
2、一定要有参比波长吗？为什么呀？
3，我加完药之后一段时间，发现孔内中心的细胞都死好多，但是边上的细胞还是特别多，是不是加药加的均匀啊？怎么样才能加均匀呢？
4、我的是悬浮细胞，密度是10的5次方每孔，好像有点大了一样，不知道你的是什么细胞啊？
谢谢，祝大家试验都顺利！

大白菜[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

参比波长是为了去除其它颜色物质的影响，感觉做cck或者elisa这种不用参比波长可能结果不会差异太大。
悬浮没做过呵呵我做贴壁细胞

bongte[使用道具]
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发表于 2012-4-24 20:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，一般是450nm测，650nm参考，以450-650作为真实值。原因就是diving战友说的去除其他物质的影响。
2，我做的主要是贴壁细胞，同实验室的有做悬浮细胞，也有panc-1，貌似是5000/孔。
3，刚开始加96孔板的时候，细胞比较容易贴到孔周围，后来发现这种现象减轻了，可能是操作更熟练的缘故，自己也可以再摸索一下方式。孔周围总是比中间多，这是正常。
3，加药后可以用抢轻轻混匀，刚开始我也不敢吹，怕把贴壁细胞吹起来。后来发现没事。不过，最终我还是采取横竖方向各轻轻拍板50-100次，用枪头又浪费又慢。完全不吹不晃的话，加入的1-2微升DMSO容易沉到底下，造成一小片细胞死亡。
4，关于怕浪费不起cck-8的问题，我们新手可以这样克服：如果显微镜下看见你的细胞长的过满，或者肉眼无见明显梯度死亡（本来有用的药，比如对照药反而无效或者杀死过多等）或者预感结果不太好（不符合预期），可以用mtt或者mts（这个是490测值，楼上那位不妨考虑下，就是要避光，数值不如cck-8稳定）等代替测，实在不行，拍照数数活细胞也可以考虑。如果肉眼观察都不满意，何苦浪费试剂（可惜我是浪费了很多之后才知道这句话，知道了这句话时候我也无需浪费了，哈哈）。
5，做之前，最好摸一下细胞密度（一般细胞5000就ok，我有些细胞长4天才满，所以用了10000，后来都改成5000了），值偏大时可以减少种板细胞数，也可以减少cck-8作用时间，如我们的细胞中有的要加cck-84个小时做，有的一个小时值就老高了。刚开始如果不知道什么时候测合适，就一个小时测一次，快点测完后拿回去。一般熟练后肉眼看颜色就知道值大概有多少了。各种细胞不同，不可一概而论。

祝各位尽早获得好结果~

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