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标题:[求助]如何进行小鼠皮肤成纤维细胞的培养？

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发表于 2012-4-29 09:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何进行小鼠皮肤成纤维细胞的培养？



我做小鼠皮肤原代成纤维细胞培养，发现小鼠的皮肤非常薄，根本无法分离表皮和皮下组织，即使用0.25%的胰蛋白酶4度过夜，也无法分开，只好一起放入培养瓶中，不知是否可以，
还有没有胶原酶，只好继续用0.25%的胰蛋白酶37度消化60分钟，不知是否可以，因为没做过小鼠原代细胞培养，心里没数，向各位请教。
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发表于 2012-4-29 09:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

方法完全错误。如果运气好，可能侥幸成功。
正确方法：
1. 消化法：必须用胶原酶消化；
2. 组织块法：用锐利刀剪，组织块不必剪得很小，米粒大小即可，放置在6孔板内，一孔内5-6个组织块，加入少量液体，以组织块不漂起为宜，第二、三天换等量液体。表皮不必去除，只要保证真皮面朝下即可，上皮细胞不可能在真皮细胞培养环境下生长。
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发表于 2012-4-29 09:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但也有文献报道可以用胰酶消化的，但一致认为胶原酶效果好，我目前还没有胶原酶，故只能用胰酶消化。
组织块法好像文献没说要真皮面朝下啊，上皮细胞还是有可能和在真皮细胞培养环境下生长，二者培养基条件也差不多

还有不知几天才能长出细胞啊。

希望大家继续指教
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发表于 2012-4-29 09:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有一个看起来很傻的问题：
胰酶消化过夜，胰酶里没有营养成分，过一夜皮肤组织会坏死吗？或把胰酶化在不含血清的DMEM里，好像大家介绍的就是4度胰酶过夜。
到底如何，望大家指教
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发表于 2012-4-29 09:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
正如楼上童鞋所说，胰酶把成纤维细胞杀完了，没能培养成功，看了童鞋的帖子，感觉非常有道理。但对你所说培养方法有几点不懂；特请教
1.别的方法介绍用胰酶4度过夜，你为何用胶原酶过夜。
2. 625U/ml I 型胶原酶 如何配啊
3 开发培养是否就是瓶口不要太紧，对吗？

4.我做的是小鼠C57BL/6小鼠，大概4w左右，胶原酶浓度和消化时间如何掌握。
望楼上能赐教，不胜感谢
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发表于 2012-4-29 09:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1. 胰酶4度过夜是为了去掉表皮，实际上这一步不做亦可，表皮细胞培养难度很大，在成纤维细胞培养液中难以成活；
2. 625U/ml胶原酶用Dhanks液或者无血清培养基配制都可以；
3. 胶原酶不必4度过夜，37度直接消化至大部分组织消失就可以；4度过夜的话，胶原酶能够浸透组织，第二天37度继续消化，效果更好；
4. 瓶口要保持透气，否则细胞迅速死亡；
5. 小鼠的细胞比人的细胞难养得多，具体条件要多摸索；不过成纤维细胞还是比较容易培养的；最好用新生还没长毛的幼鼠，培养成功率更高。
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发表于 2012-4-29 09:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我按照你的protocol，把小鼠的皮肤切成小片，用sigma的1型胶原酶消化2.30小时，待大部分组织消失，离心，冲洗，台盼兰染色，见较多活细胞，在培养瓶培养，今天上午，14小时了，但没见fibriblast贴壁，是我的操作有什么问题，还是消化后，本身贴壁较慢啊，
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发表于 2012-4-29 09:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #7 cocacola 的帖子

1. 一般来说，14小时细胞应该贴壁了，不过可以等等看；
2. 台盼兰染色用处不大，没必要做；
3. 不行再试试组织块法。
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cocacola[使用道具]
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发表于 2012-4-29 09:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #8 flower-201 的帖子

今天终于看到细胞贴壁了，感觉好像是成纤维细胞，跟你发的图比较象，我的细胞已40小时，应该几时换液，换液要注意什么？
非常感谢skinner，非常大的帮助，同时建议版主给skinner加分
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发表于 2012-4-29 09:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，祝贺！
可以换液了。最好是半量换液，即保留一半原来的培养液，补足新培养液。
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