[求助]胶原酶消化后没有细胞

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]胶原酶消化后没有细胞

11 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]胶原酶消化后没有细胞

ritou1985[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77664
精华 0
积分 644
帖子 948
信誉分 100
可用分 5596
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2012-4-29 09:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位好，我昨天用1mg/ml SIGMA 1型胶原酶消化角膜基质，3个小时后角膜基质消失，镜下没有看到细胞，离心，发现什么也没有，各位指教一下，我的消化有什么问题吗，会不会消化过了啊，但是文献都消化过夜呢，望不吝赐教，谢谢！

ritou1985[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77664
精华 0
积分 644
帖子 948
信誉分 100
可用分 5596
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2012-4-29 09:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

又实验了一下，还是没有细胞，哪位赐教一下啊，十分感谢！

ritou1985[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77664
精华 0
积分 644
帖子 948
信誉分 100
可用分 5596
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2012-4-29 09:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

操作过程

1 三只SD大鼠处死后，眼球取出，浸泡在含庆大霉素 2000U/ML 的PBS里约20分钟
2 无菌条件下把角膜取下后，浸泡在含 EDTA 20mM 的PBS里 37度 20分钟
3 用刀片把内外表层刮除
4 角膜基质在DEMM/F12中冲洗后，切成4半后，浸泡在含胶原酶1mg/ml的DEMM/F12中 37度 3-4h
5 吹打溶液，离心管离心2500rpm后吸取上清后，加KSFM吹打后培养

ero11[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 75131
精华 0
积分 684
帖子 1028
信誉分 100
可用分 5953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态离线

发表于 2012-4-29 09:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的也出现这种状况，目前还不知道怎么原因，正在查找中。请高手赐教

xingyi08[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76899
精华 0
积分 496
帖子 671
信誉分 100
可用分 4201
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2012-4-29 09:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

37度3-4个小时再牛的细胞怕是都消化成碎片了。。。你镜下应该能看见很多细胞碎片吧~~建议37度短时间分次消化。

mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态离线

发表于 2012-4-29 09:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以使用培养液配置胶原酶
还有就是这个样品里面的细胞本来就很少
所以在培养的过程中要更加的小心呵护

c86v[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77054
精华 0
积分 442
帖子 584
信誉分 100
可用分 3741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2012-4-29 09:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

消化三四个小时确实有点长了啊，上面的楼主说37度短时分次消化是什么步骤，胶原酶不是用平衡盐溶液配吗？用无血清的培养液配效果怎么养呢？

october7[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77254
精华 0
积分 448
帖子 616
信誉分 100
可用分 3856
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

发表于 2012-4-29 09:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实不是消化的问题，而是操作的问题，操作造成细胞的死亡，我试过不同浓度的胶原酶，最大在5mg/ml 消化5个小时，平时是2mg/ml消化18小时，都在37度，细胞活性还是很不错的。
胶原酶是用基础培养液配置的

zhenxin[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76024
精华 0
积分 748
帖子 1216
信誉分 100
可用分 6848
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-31
状态离线

发表于 2012-4-29 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 october7 于 2012-4-29 09:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

其实不是消化的问题，而是操作的问题，操作造成细胞的死亡，我试过不同浓度的胶原酶，最大在5mg/ml 消化5个小时，平时是2mg/ml消化18小时，都在37度，细胞活性还是很不错的。
胶原酶是用基础培养液配置的 ...

能详细讲讲操作中的注意事项吗?谢谢啊.到底是什么操作不能看见细胞

october7[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77254
精华 0
积分 448
帖子 616
信誉分 100
可用分 3856
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

发表于 2012-4-29 09:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #10 zhenxin 的帖子

是在前期处理过程中太过于粗暴（刮除上皮和内皮），后来把刮除这步骤改掉就好了。

11 1/2 1 2 ››