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大致实验方法:
WB 对总蛋白的检测是利用RIPA裂解液裂解细胞,WB检测蛋白的表达,没有变化。
WB对细胞膜的检测是通过检测与细胞骨架结和的目的蛋白(我们检测的是p120ctn蛋白,他只有与E-cadherin集合后才能分布到细胞膜上,进而和细胞骨架结合,因而细胞骨架蛋白中的p120的量也可以反应细胞膜上的量):细胞利用Troton X-100 buffer (300 mM sucrose, 10 mM PIPES pH 6.8, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% Triton X-100, 0.1 mg/ml DNase I, 0.1 mg/ml RNase A, 1.2 mM PMSF) 裂解,15000g离心30分钟,弃上清,沉淀变性溶解,WB检测。也利用细胞膜蛋白提取试剂盒,检测过。结果都表明药物处理能降低p120ctn的膜分布。
共聚焦检测:利用甲醛固定、打孔后一抗和二抗孵育,共聚焦检测蛋白。
上述实验的对照和药物处理细胞同步操作。