细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]共聚焦和WB检测蛋白表达量不一致,如何解释

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:[求助]共聚焦和WB检测蛋白表达量不一致,如何解释

star#room[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76306
精华 0
积分 421
帖子 501
信誉分 100
可用分 3361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
1
 

[求助]共聚焦和WB检测蛋白表达量不一致,如何解释



我检测一个药物对某蛋白的表达和分布的影响。
WB结果表明药物对该蛋白的表达量没有明显影响,但是膜蛋白中该蛋白的量明显降低;共聚焦结果显示不仅细胞膜中该蛋白的量降低,细胞质中也显著降低。实验重复了好多次都是如此。请各位战友帮忙分析一下原因。
多谢!!
顶部
nn255[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
2
 
实验步骤写上来
我觉得是操作问题
顶部
star#room[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76306
精华 0
积分 421
帖子 501
信誉分 100
可用分 3361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
3
 

大致实验方法:

WB 对总蛋白的检测是利用RIPA裂解液裂解细胞,WB检测蛋白的表达,没有变化。

WB对细胞膜的检测是通过检测与细胞骨架结和的目的蛋白(我们检测的是p120ctn蛋白,他只有与E-cadherin集合后才能分布到细胞膜上,进而和细胞骨架结合,因而细胞骨架蛋白中的p120的量也可以反应细胞膜上的量):细胞利用Troton X-100 buffer (300 mM sucrose, 10 mM PIPES pH 6.8, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% Triton X-100, 0.1 mg/ml DNase I, 0.1 mg/ml RNase A, 1.2 mM PMSF) 裂解,15000g离心30分钟,弃上清,沉淀变性溶解,WB检测。也利用细胞膜蛋白提取试剂盒,检测过。结果都表明药物处理能降低p120ctn的膜分布。

共聚焦检测:利用甲醛固定、打孔后一抗和二抗孵育,共聚焦检测蛋白。

上述实验的对照和药物处理细胞同步操作。
顶部
nn255[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
4
 
首先,WB 对总蛋白的检测建议换下裂解液,RIPA可能对膜蛋白裂解不充分,可以试下直接用1*Loading Buffer裂解细胞,这样再看下药物作用对你总p120ctn表达的影响。
其次,共聚焦检测你用的是(多聚)甲醛进行的固定,这种固定剂可能对可溶性蛋白效果不是太好,这样可能会导致你免疫荧光染色过程中胞浆分布p120ctn的流失。可以试试50%丙酮+50%乙醇,或者其他固定液。

仅供参考。
顶部
star#room[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76306
精华 0
积分 421
帖子 501
信誉分 100
可用分 3361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
5
 

回复 #4 nn255 的帖子

谢谢你~
直接用1*Loading Buffer裂解细胞做WB试过,效果没有区别;
我会换固定液试一下,希望能如您所说,非常感谢!
顶部
ffooll[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73418
精华 0
积分 437
帖子 574
信誉分 100
可用分 3666
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
6
 

提一个简单的问题,你使用的抗体是否为同一个抗体,能否说一说一抗的特异性问题,换句话说除了目标条带外,上下是否还有其他非特异性条带?WB通常只比较目标区域条带的深浅。但是免疫荧光时候,那些WB非特异性条带都能发光的。

免疫荧光不是定量研究蛋白的好办法,通常用它来观察结构的改变和位置的改变。WB得出的是上万个细胞的平均值,免疫荧光给出的是少数细胞的值,只是一个局部。看看大量文献中共聚焦通常只展示一到两个细胞的图片,这是不科学的。因为只要用心,总能在众多细胞中找到你需要的荧光图片。

仅供参考
顶部
伊莎贝拉[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79367
精华 0
积分 253
帖子 226
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
7
 

我们是同一个课题组,先回答楼主问题,该抗体在做WB时 除特异性条带外有少量非特异性带,但非特异性带不明显。我认为,免疫荧光时加不加药物都有非特异性结合,不会影响p120的变化趋势。

第二 nn255的建议已试过,和多聚甲醛固定得到的结果是一致的。

第三,可能是下面原因吗?请群友分析分析

p120分布膜上是和A蛋白结合,分布胞浆是和B蛋白结合,抗体无法识别或者较弱识别胞浆的p120,免疫荧光主要显示膜上的p120,加药后膜上有明显减少,其实胞浆内有明显增多,只是显示不出来,导致看上去加药后总量减少了。
顶部
star#room[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76306
精华 0
积分 421
帖子 501
信誉分 100
可用分 3361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
8
 

回复 #7 伊莎贝拉 的帖子

p120经药物处理发生磷酸化,与E-cadherin分离而游离到细胞浆中,然后与Kaiso转录因子结合进入核内,这个时间大约在30min+(根据一篇中文文献,不敢确定)。不知你的药物作用时间是多少?有无注意核内的表达量变化?有无检测p120磷酸化水平?
顶部
nn255[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76746
精华 0
积分 652
帖子 1024
信誉分 100
可用分 5877
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
9
 

楼上您好,没想到您也是做p120的专家。我药物处理的时间是48h(短时间处理没有效果),免疫荧光检测不到p120在细胞核中分布。将一张图片附上,请帮忙分析,多谢。


查看积分策略说明
附件
2012-4-29 11:25
52122357.jpg (37.34 KB)
 
顶部
伊莎贝拉[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79367
精华 0
积分 253
帖子 226
信誉分 100
可用分 1911
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
10
 


有一篇MBC的文章大概您也看过,所做一部分实验跟你们大致相同。他们发现,幽门螺杆菌处理可引起p120细胞分布的变化,但总量在蛋白水平和mRNA水平均没有变化,主要表现在Soluble(胞浆)部分随处理后时间延长其量逐渐降低,insoluble(核和膜)部分的量则是逐渐上升。这点也得到了p120磷酸化水平降低的证明。但是从他们提供的免疫荧光的图上也没有发现处理后胞浆的量逐渐降低的表现,因为在没有处理的细胞里就没有看到胞浆蛋白。或许正如前面战友所说,免疫荧光不是很标准的蛋白定量研究方法,所展现的也未必是真实的情况。
p120 and Kaiso Regulate Helicobacter pylori-induced Expression of Matrix Metalloproteinase-7


查看积分策略说明
附件
2012-4-29 11:26
45242005.jpg (66.33 KB)
 
顶部