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标题:[求助]HepG2转染的相关问题

qhyu[使用道具]
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[求助]HepG2转染的相关问题



准备做hepg2的转染试验了,实验室常用的的是lipofectamine 2000,听说hepG2的转染效率很低,并且这种细胞比较容易成团,这会影响转染效率吗?是否用trypsin+EDTA可以使其成为单个细胞不成团?哪种转染方法更适合hepg2?需要改用电转吗?如果用lipofectamine 2000,加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况,谢谢!
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sunnyB[使用道具]
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HepG2用lipo2000在我们实验室做的转染效率很高的,可以到70-80%,不必担心。不需要用电转,磷酸钙法也可以有40-50%的
操作上主要注意:
1,细胞铺板时的状态很重要,应该在铺板前尽量消化为单细胞悬液,trypsin+EDTA充分吹打即可
2,转染前1天铺板,待转染时密度刚好达到80-90%,不能太低,但是也不能长过(细胞成团,堆积)。最好是刚刚长满,此时还在对数生长期
3,加入的质粒要去除内毒素,plasmid:lipo约为1:0.5-1:5。实际上采用说明书的推荐量就很好,1:2.5
4,用前自己好好看一遍说明书,哈哈
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qhyu[使用道具]
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3
 

HepG2细胞的确相对于CHO等细胞而言转染效率比较低,但也只是相对。据我们实验室的经验,用lipofectamine 2000转染HepG2完全没有问题,无论是瞬时转染还是稳定转染,也无论是转一个质粒还是共转染两个质粒(转两个以上没有试过)。但有些问题需要注意一下:
1、lipofectamine 2000毒性比较大,所以建议转染6 h后换去转染培养基;
2、采用先铺板再转染的方式比采用同时转染的方式效率会高,但需根据实验需要设计,如果采用前种方式,细胞的汇合度一定要在80%以上再转染(说明书上好像是达到90%);
3、采用0.25%的trypsin+0.02%EDTA消化细胞传代,弯头吸管稍加吹打,可使细胞分散的很均匀,消化的时间一定要掌握好,时间不够不易吹下且对细胞造成机械损伤,消化过了成片脱落,再想吹打成单细胞悬液就不容易了;
4、根据脂质体介导细胞转染的原理,在质粒提取时要除去内毒素,否则会降低转染效率;
5、对于转染时DNA和脂质体的量说明书上有个推荐的范围,DNA (μg):Lipofectamine™ 2000 (μl) =1:0.5 ~ 1:5,可在此范围内设几个梯度摸索一下,从而找到最适比例;
6、转染时用于稀释脂质体和DNA的培养基一定是无血清的,血清会干扰转染,还有脂质体稀释液和DNA稀释液要充分混匀并孵育足够时间,以使脂质体将DNA颗粒包裹好进入细胞。

先想起这么多。多多交流!
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fklo83[使用道具]
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请教楼上的高手为什么我用磷酸钙共沉淀法转染HepG2 3小时左右后细胞全部死亡啊,已经连续两次出现这种情况了,很着急,楼上高手帮忙分析一下吧
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summerxx[使用道具]
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HepG2用lipo2000在我们实验室做的转染效率很高的,可以到70-80%,不必担心。不需要用电转,磷酸钙法也可以有40-50%的
操作上主要注意:
1,细胞铺板时的状态很重要,应该在铺板前尽量消化为单细胞悬液,trypsin+EDTA充分吹打即可
2,转染前1天铺板,待转染时密度刚好达到80-90%,不能太低,但是也不能长过(细胞成团,堆积)。最好是刚刚长满,此时还在对数生长期
3,加入的质粒要去除内毒素,plasmid:lipo约为1:0.5-1:5。实际上采用说明书的推荐量就很好,1:2.5
4,用前自己好好看一遍说明书,哈哈

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,转染前1天铺板,待转染时密度刚好达到80-90%

我也在做这个细胞,10cm 板, 1ml Trypsin+1ml Medium.取150ul接到6-well-plate (2 ml), 达到80%须4天。能否介绍一下你是怎么做的,解解了先。
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greenbee[使用道具]
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隔天转染是最理想的,但这个条件和细胞生长速度,铺板密度,培养基条件相关,是要摸出来的。
首先你的克隆的增殖速度要较快,这个和你的细胞代数,此前的营养状况有关,有时多次传代后细胞状态会变差,贴壁时间过长,建议采用复苏后10-20代内的。我们还用过高血清(15%-20%)来调整生长速度,但是这点有时会改变细胞激活或基因表达状态,慎用
其次是接种密度。对于贴壁细胞我是不计数的,太麻烦,就算传代比例。一般1:2-1:3传代可以1天长满。必要时候增加量。但是如果生长过慢,单纯增加铺板密度也没什么意义,因为脂质体要求转染增殖期细胞的。此时还是要回到第一步去摸索。

10cm(60cm2)到6-well(10cm2)为6:1,按你的目前描述算下来大约是1:2传代,比较合适的密度,所以主要问题应该在你的细胞状态上。不知道你的克隆生长速度怎样?或者传代最后保留的Trypsin太多了,最好吸掉或者用较多Medium终止。消化时间对于细胞状态也很关键。
祝你成功!
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qhyu[使用道具]
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我的细胞一直长的很慢, 故想在短时间内提高覆盖率。 我也尝试洗掉trypsin,仍然不行。而且新的问题出来了, 三天换一次培养基至9天时开始出现短杆状异物,疑为染菌。继续培养就知道是出现染菌了。但异物形态变为点状,生长速度极快。一两天就覆盖整个平板,现在很头疼,望大家不吝赐教。
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各位大侠,我是初学者刚接触实验,我要做的是把siRNA真核表达载体转进HepG2细胞中再作MTT测细胞增殖情况,我也想用lipo2000转染,是否瞬转效果较好?请教各位谁有这方面的经验和具体操作步骤,发给我好吗?我的邮箱是yjj_0415@163.com.具体怎么做和注意什么请多多指教,不胜感激,先谢谢各位了!
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各位前辈,我想做siRNA真核表达载体转染HepG2细胞中再作MTT测细胞增殖情况,请问做瞬转可以吗?我是不是可以把时间间隔设的短一些,以免瞬转带来的影响,请各位高手指点迷津,谢谢!不胜感激!
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爱老虎游tt[使用道具]
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可以的,瞬转siRNA 推荐的就是lipo2000,Invitrogen公司有详细的说明书可以下载
瞬转至少可以维持3-4天,我们都是72h检测RNAi效率的。再留出一点细胞增殖的时间,你试试4天时检测怎么样。
但是你最终要用MTT检测增殖,所以还有个问题:Lipo2000转染密度不能太小,即使80%融合度转染,4天后每组很可能都已经长满,组间差异可能难以体现。你可以尝试传一次代试试看,也就是是在转染后24h左右1:3传代,4天时测定一孔或者3孔的MTT值来计算
够条件的话,推荐H3掺入法
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