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标题:[求助]亚细胞定位GFP融合蛋白在核内呈点聚集状

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[求助]亚细胞定位GFP融合蛋白在核内呈点聚集状




GFP融合蛋白,803细胞爬片,lipo2000转染48小时,荧光显微镜拍照。

现在观察到的蛋白是定位在核内,但是有两个问题需要大家帮忙看看

1.蛋白荧光强度不错,说明表达高,但在核内多呈聚集点状分布,如下图绿光显示,我对形态学和亚细胞结构不甚了解,想请问各位:如果一蛋白在核内,是聚集还是弥散状都有,如果聚集得厉害,和什么细胞器或者染色质相关吗,请有这方面经验的战友各抒己见

2.DAPI染核后,发现GFP阴性(即未转染进去)的细胞,染核可见。
而 GFP阳性(即转染目的基因)进去的细胞,染核都几乎已不可辨认,需要调节不同的焦距才能隐约看到点核的样子

问题:这些GFP阳性的肯定是蛋白吧,那就是说,DAPI染的DNA已经快没有了,不管是降解还是别的原因,核的形态也没有了,那是不是说高表达(因为此时还能看到发荧光的蛋白,亮度很强)基因的细胞,都发生了凋亡或是死亡?形态学,形态学,形态学,呼唤高手。

大家走过路过,各抒己见,谢谢,谢谢。


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这些都是GFP的,大部分呈聚集状,而不是均匀散在分布在核内,所以我想知道有哪些功能方面的信息与之相关


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接上面


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DAPI 染核发现只要是GFP阳性的细胞,核的形态都染不出来了,DNA到哪去了呢。
箭头所指处就是对应的GFP阳性细胞的核染,是对应的本帖第一张图。谢谢各位了


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这个还是跟具体蛋白有关的,
如果细胞核的形态还在,GFP表达和核定位都正常的话,细胞至少没坏死掉,没可能染不出DAPI的,如果你确定每个GFP阳性的细胞DAPI都染不上,我觉得有可能你的蛋白本身对细胞分裂周期或者染色体活动有影响。
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另外你的DAPI也染的太难看了点,量加少了么?
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有没有光镜的照片?最好是光镜结合荧光观察,确定细胞转染后的生长状态怎么样?如果细胞状态不好,很可能绿色荧光是非特异的,另外,看的DAPI染的也不好,看不出细胞核的形态,很可能你的细胞已经不行了!
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8
 
另外你的DAPI也染的太难看了点,量加少了么?

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其实DAPI已经染得很亮了,但我把亮度调低,增加曝光时间,这样才能看到GFP阳性细胞中染得若隐若现的DAPI的核,否则只是看到其他没转进质粒的细胞狂亮的核了

谢谢楼上的两位朋友的解答,也谢谢版主的置顶。

我又做了一次,这次是转染前细胞无血清饥饿24小时,转染分别从3h,8h,13h,20h不同时间点检测荧光表达。

这次不是做的爬片,观察的荧光显微镜放大倍数不够,就看不了亚细胞结构,但我发现了一个现象:
3h的时候没有表达
8h开始有表达(至于是不是确切8h还有待实验,因为我就测了这几个时间点)
13h,20h 都有表达,但我每个时间点取了五个不同的视野照相,计数表达绿光的个数,发现13h,20h表达的荧光数比8h要少了,难道蛋白表达一小会就降解了??

还有,在8h开始表达的时候,绿色荧光绝大部分是离得很近的成对出现,白光下面看就是紧挨着的两个细胞,绝大部分都是这样,我想是不是正在分裂,或者是分裂末期的细胞才有这个蛋白的表达呢?下面都拍了图,请大家走过再看看吧,谢谢了
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3h的就不贴了,没什么荧光点点~~
8h的开始有荧光,而且是成对出现的居多,这种成对的GFP绿光在白光下看就是居于两个紧挨着的细胞中的,我想是不是转进去一个细胞,它分裂成两个子代细胞,最后分裂完成时这个蛋白行使什么功能,表达就高了?还是转染的质粒就是随细胞分裂表达了而已,是普遍存在的,与周期、分裂无关?请高人给个解答,谢谢


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这张还是8h的图片,可以看出也是成对的居多


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