细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]关于趋化因子在transwell里的放置，一直没想通。

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 16  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]关于趋化因子在transwell里的放置，一直没想通。

huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
1

发表于 2012-4-29 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]关于趋化因子在transwell里的放置，一直没想通。




如果做某种趋化因子对细胞的迁徙实验，既然液体可以通过膜自由流动，那所谓的“在下室放置趋化因子看是否会使细胞受到影响而穿透膜到达下室”中的“在下室放置趋化因子“有什么意义呢，放在上室也一样啊？

同样，如果做趋化因子对细胞的迁徙实验时，区别就是在膜上铺了一层胶来模拟人的基底膜，然后在下室放上趋化因子使细胞受趋化后分泌酶把胶消化掉而在穿透膜到达下室，在上室的细胞既然受到趋化，意味着本来放在下室的因子也穿透膜和胶到上室来了，也就是说因子可以自由在上下室之间流动，那这些因子还不是放哪里都一样？为何一定要放下室？

再有就是所谓上下室不同培养基的问题，既然液体可以自由流动，那不是混在一起了吗，如何保持二者分开的啊？

小弟刚接触这个transwell，还请高手解答，非常感谢您的帮助！
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
2

发表于 2012-4-29 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果做某种趋化因子对细胞的迁徙实验，既然液体可以通过膜自由流动，那所谓的“在下室放置趋化因子看是否会使细胞受到影响而穿透膜到达下室”中的“在下室放置趋化因子“有什么意义呢，放在上室也一样啊？

同样，如果做趋化因子对细胞的迁徙实验时，区别就是在膜上铺了一层胶来模拟人的基底膜，然后在下室放上趋化因子使细胞受趋化后分泌酶把胶消化掉而在穿透膜到达下室，在上室的细胞既然受到趋化，意味着本来放在下室的因子也穿透膜和胶到上室来了，也就是说因子可以自由在上下室之间流动，那这些因子还不是放哪里都一样？为何一定要放下室？

再有就是所谓上下室不同培养基的问题，既然液体可以自由流动，那不是混在一起了吗，如何保持二者分开的啊？

小弟刚接触这个transwell，还请高手解答，非常感谢您的帮助！
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
3

发表于 2012-4-29 13:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
情况是这样的。虽然上下室之间的膜上有小孔，但是孔径较小，一般<8 um, 所以下室放趋化因子，而上室没有的情况下，这些因子不是立刻就达到上下室平衡的，而是一开始有个浓度的Gradient, 细胞会收到信号而向下移动。但是这个浓度的梯度是会随着时间慢慢减少，最终达到上下室一致，这时细胞的迁移也就会停止了。所以这个试验的时间一般建议6-10小时，时间放长了，也没意义。
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
4

发表于 2012-4-29 13:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有在侵袭实验中看很多帖子都用不同来源的胶来铺在膜上而模仿基底膜，而真正基底膜的成分是层粘连蛋白、4型胶原和起连接作用的多种糖蛋白，那我们自己铺的这个胶或公司预铺的胶能达到这个标准吗，如果不能，我们怎么能根据这个失败的基底膜模型来评价侵袭结果？

一些文献在膜上先接种内皮细胞，等铺满单层后在加入另一种细胞的悬液，然后描述在下室加入趋化因子（既然膜和内皮细胞层有通透性，那为何不直接在上室加？如果内皮细胞层没有通透性，那加入下室的趋化因子是怎么影响到上室里的细胞的？很多疑问）来观察是否细胞受趋化后穿过内皮细胞而到下室，那又有疑问了，就真的有那么一个精确的膜的孔径能允许内皮细胞生长而不漏到下室，同时又允许悬液里的细胞穿过？？如果内皮细胞也漏到了下室，那这个内皮细胞层模型也是失败的吧。

关于迁徙实验也没想通，在不加趋化因子时，加在上室的细胞受膜孔径的限制应该是不进入或少量进入下室，加了因子后细胞变形穿过膜而到下室，那膜的孔径就直接决定穿透细胞的数量，我们怎样选定的这个孔径？是根据细胞的大小吗，那么多不同种属的细胞我们从哪里知道它们的大小的，并且我们不知道细胞受趋化变形后的大小，那膜的孔径怎么选才精确？比如选的3cm的孔径在不受趋化时直径6cm的细胞完全不能通过，受趋化后如果细胞只能变成4cm，还是通不过，那这时的趋化结果就是阴性，但实际上是膜的孔径没选对，是这样吗？

该不会transwell本身就是个大忽悠吧，大家有什么经验吗，谢谢了。
顶部
kewanqi2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76114
精华 2
积分 534
帖子 660
信誉分 104
可用分 4146
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2012-4-29 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人觉得你把简单的问题想复杂了。就我所知，膜上不是只有一个孔，而且密布很多pore。通常选择孔径大于3 um的膜，8um的用得比较多，大多数细胞都能通过。你说的直径6cm的细胞，本人未听说过这种giant的细胞。通常做细胞迁移实验的，多为内皮细胞或者癌细胞或者纤维细胞。所以不必为孔径担心，买8um孔径的膜就足够。
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
6

发表于 2012-4-29 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感楼上的关于趋化因子的解答，我总算弄懂了；但关于孔径的问题我再好好琢磨一下，不懂的地方可能还要来麻烦您，再次感谢，周末愉快。
顶部
qumm1985[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76908
精华 1
积分 475
帖子 546
信誉分 102
可用分 3616
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
7

发表于 2012-4-29 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好！我也在用transwell做细胞迁移实验，做得是神经干细胞，但我做得就迁移不过去啊。
是不是膜上一定要涂胶原什么的，我就沾了一下多聚赖氨酸，文献上也是这么做得。
麻烦做过的人帮我分析一下哦，非常感谢。
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
8

发表于 2012-4-29 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 迁移实验和侵袭实验的不同：
迁移实验指的是不涂胶原的东西。
侵袭实验指的是涂胶原之类的东西。一般侵袭特性是肿瘤细胞所特有的，肿瘤细胞可以分泌酶类将胶原等消化，从而穿过膜。

2. 上下室的关系：
上下室完全隔离开来的两个培养体系。注意：一定要控制上下室的加样体积。正如ryanhe 所说，因子形成了一个梯度。所以需要加在下室。

3. transwell的统计意义：
需要设置3平行和对照组。有人认为较高浓度和较低浓度的因子均对细胞没有趋化作用，所以需要查阅文献找到适合的因子浓度。验证也可以加入抗体或者特异性的抑制剂实验组。

4. transwell的接种密度和培养时间：
不同的细胞不同。请查阅文献。
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
9

发表于 2012-4-29 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的解答，我对细胞最后的停留位置还是不清楚，能否再向您请教两个问题，比如对于这篇文献“创面分泌液对表皮干细胞体外趋化作用的实验研究”中方法有这样的描述：

将整个Transwell 小室置于 孵箱中作用12h 后,取出Transwell 小室,PBS 冲洗,用棉签轻轻擦去微孔膜上层的细胞,95 %乙醇固定微孔膜下层细胞,苏木精染色后高倍镜下计数。取6 个高倍镜视野的细胞均数作为该样本从微孔膜上
层迁移至下层的细胞数。

文章中的方法中没有铺胶，我原来理解是这些细胞受趋化后是穿过膜到达下室的底面上了（也就是24孔或者N孔板的底面），但看这篇文献中说的好像不是这样，它用棉签擦去微孔膜上层的细胞是否是还没有穿过膜的细胞？“固定微孔膜下层细胞”中的下层细胞在哪里呢，不在N孔板的底面，难道是在膜的下面，类似于天花板上的那个位置吗？

如果是做铺胶的侵袭实验，细胞穿过胶后是停在膜的上表面还是穿过膜到达N孔板的底面、还是如上面所请教的是否悬在膜的下面了？

看了说明书，都是说“lower side of the filter”或者“underside of the membrane”，由于没有用过，一头雾水，所以想向您请教，很不好意思，问了这么多，谢谢您的帮助！
顶部
乌贼老弟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74586
精华 0
积分 336
帖子 411
信誉分 100
可用分 2791
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
10

发表于 2012-4-29 13:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 关于孔径大小的描述我没有讲清楚:
细胞铺展开来的时候和刚刚消化下来的大小是不一样的，铺展开来的时候大而刚消化下来的细胞呈圆形，体积要小。膜的孔径只要比圆形的细胞大就可以了。因为受到下室趋化因子的影响，细胞会变形通过。

2. 上室的细胞接种后会在膜上贴壁，并铺展开来。检测的时候，检测的是膜反面的细胞，根据我的观察细胞这个时候是圆形的，也就是变形后挤过去的。

所以必须控制好接种细胞后趋化实验的培养时间，我们在下室的确是能看到细胞的，是因为贴在膜反面的细胞掉下去的。

3. 最后的检测我用的方法是：
0.1%结晶紫的方法。
顶部
 16  1/2 12››