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标题:[求助]请教高手有关人卵巢组织窦前卵泡的分离方法

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[求助]请教高手有关人卵巢组织窦前卵泡的分离方法



本人用的是胶原酶消化方法。但是每次从卵巢组织中获得卵泡的数目很少。在此提供自己的方法,请高手指出不当之处:
1。手术室获得卵巢组织,放入含10%FCS的1640培养基中,夹于冰块间,置于保温桶送回实验室。时间20分钟。
2。用1640培养基清洗组织2-3遍,洗去血污,组织浸在上述培养基中,将卵巢髓质部分、黄体组织、血体等剪掉丢弃,皮质备用。假设目测组织体积为2cm× 1cm×0.5mm ,约0.1mL,则含胶原酶的消化液应该是2mL,按照文献I型胶原酶的浓度为200IU/mL,即1mg/mL, 浓缩液是10mg/mL。
3。准备一无菌的玻璃瓶,加入1.8mL1640培养基和0.2ml的10mg/mL的型胶原酶。将修剪好的皮质片用无菌滤纸洗干水分后,放入上述玻璃瓶,用锐利剪刀将其尽量剪碎,并充分混匀。
4。37度CO2培养箱内孵育2个小时,每隔15分钟用吸管吹打一次。
5。用50%浓度的FCS终止消化,即在上述消化混悬液内加1mlFCS,充分混合。
6。用吸管小心吸取上述混悬液,将其滴在孔径80um的细胞滤网上,下面接一干净的培养皿,收集细胞悬液。
7。收集细胞悬液在解剖显微镜下寻找窦前卵泡。
很难找到卵泡,找到后有时又在一堆粘稠的卵巢基质得消化液中,较难取出。解剖显微镜又不能照相。自己用自己的照相机对着目镜进行了拍摄,见下图,如果没有足够的卵泡下边的步骤就没法进行了,不知各位能不能想想办法。谢谢了


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有没有做过这方面实验的大家一起探讨一下。
自己在细胞方面比较初级,如果能有更好的方法可以少走不少弯路。
以下搜到了一篇机械法分离未成熟卵泡的方法,不知有哪位战友做过,效果如何,提供点细节本人想试一下。
卵巢浸入37度,无钙、无镁的D-Hanks液中,10分钟送回实验室。
无菌D-Hanks液冲洗标本3次,去除血污。
浸入装有无菌D-HANK'S液的平面皿中,
以12号无菌钝枕头刮卵巢组织内外表面,直至呈绒毛状。
将不成熟的OCCC,和裸卵用毛细吸管移入D-KANK‘s液中洗3遍。
不知道这种方法如何,有没有人尝试过。
能否给点建议,谢谢
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我们做的是牛的窦前卵泡(腔前卵泡,我们的操作没有那么复杂,也不用酶消化。简单的过程就是,将牛的卵巢从屠宰厂取来后在预热好的生理盐水中洗两边,然后在玻璃板上直接将卵巢在玻璃板上用刀片切成薄片(刀片越薄越好,就像刮胡刀一样,最好有手柄,我们用的是我老板以前从英国实验室带来的,其实自己可以做的,动脑筋就行),组织切的越薄越好,然后放在洗卵液中,当切到一定组织薄片的时候,就在显微镜下观察,从组织片上剥离卵泡,左手个拿一个带柄的钢针来固定组织片,右手那一个带柄的钢针,这个钢针的头上有一个非常小的铁环(越小越好),用来将组织片上的卵泡勾出。当取到一定程度的时候就检卵。总之从卵巢上分离腔前卵泡的方法很多,国内也有不少人做,你找找广西大学一些毕业硕士、博士的论文看看,他们做的也是牛的,我想牛和人的应该差不多吧。
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谢谢,很好的答复。

要是能把你们刀片图片发上来就更好了。我好自己学着搞一个。

刀片的方法后来我们也想到了,就是消毒的刮胡刀不过就是没有柄,

带柄的钢针我觉得也很好,我们是用师姐教给的用1mL注射器针头。这个带铁环的东西用在人卵巢组织怎么样,还得试试。

请问楼上的是哪个专业的?农业的?搜了一下广西大学的硕士、博士论文没有?
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笑弯了腰[使用道具]
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楼主的实验有悖于伦理吧?
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笑弯了腰[使用道具]
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“1。手术室获得卵巢组织,放入含10%FCS的1640培养基中,夹于冰块间,置于保温桶送回实验室。时间20分钟。”
为什么是要放在冰块间呢,一般都是在预热的无菌加双抗的PBS中运送吧
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四福晋[使用道具]
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楼主的实验有悖于伦理吧

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Fertility preservation for young patients with cancer: who isat risk and what can be offered?
Lancet Oncol 2005; 6: 209–18
W Hamish B Wallace, Richard A Anderson, D Stewart Irvine
Estimates suggest that by 2010, one in 715 people in the UK will have survived cancer during childhood. Withincreasing numbers of children cured, attention has focused on their quality of life. We discuss the causes of impairedfertility after cancer treatment in young people, and outline which patients are at risk and how their gonadal functionshould be assessed. With the report of a livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue andthe continued development of intracytoplasmic sperm injection for men with poor sperm quality, we assess established and experimental strategies to protect or restore fertility, and discuss the ethical and legal issues that arise.
1. 为什么运输卵巢组织时用冰块,而不是37C?
有文献是这样做的,Tissue was immediately transported from the operat-ing room to the research laboratory in HEPES-buffered Modified Eagle Medium (HEPES-MEM; Gibco) on ice.
Ovarian cortical fragments were obtained using biopsy grasping forceps from an avascular portion of the ovary devoid of visible follicles or luteal tissue, and before elec-
trocoagulation of the puncture site. The specimens wereimmediately transported to the laboratory in Leibovitz L-15 medium (Eurobio, Les Ulis, France) at 4°C. Ovarian cortex was dissected and cut into small pieces (1 mm in thicknessand 0.5 to 1 cm2 in area) on ice.
我自己是觉得刚从手术室取得的组织如果在冰上可以减少组织缺血,有助于组织的存活,有助于卵泡的存活。不知道您说的37度有什么理由,我也看到过37度的,那是从人卵巢组织中机械分离GV期的卵,然后做IVM。
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直接 用刀片刨开卵巢皮质 ,然后在体视镜下分离小的卵泡腔,用1ml注射器针尖刺破卵泡腔,腔前卵泡举会释放出来,整个过程在无钙、无镁的PBS中进行,速度是慢了点,但确实能捡很多腔前卵泡,一个牛的卵巢有成千上万个腔前卵泡。
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看到上面几位高手提供的方法,我觉得对我有很大的帮助,我正打算做小鼠的卵泡培养,我看文献上报道的是有胶原酶和DNA酶消化卵巢组织,不知道几位高手有没有这方面的经验,我是学生殖的!
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nn255[使用道具]
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我做的是大鼠的窦前卵泡,我直接分离的。
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