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标题:[求助]细胞复苏后全死了。

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞复苏后全死了。




冻存前细胞状态很好。但我连续复苏了两支都死了。到底那些环节出了问题。。。郁闷中。。。
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49888[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是否因为冻存的时候方法不当导致了冻存之后大量细胞死亡，所以复苏的时候才逗死掉了。或者是复苏的方法不当导致的呢？
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了了[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也曾经碰到这种事情，一般如果有小量细胞存活，多是由于冻存的原因。如果什么都没有，那就怀疑是不是复苏的问题了。
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

冻存的步骤：1，配冻存液，1ML DMSO，2ML 血清，7ML培养基，共10ML。
2，离心收集细胞。
3，加6ML冻存液于离心管中，制成细胞悬液。
4，取1.5ML细胞悬液于2ML冻存管。
5，封口胶封好冻存管。4度30min ，-20度30min，-80度保存半月复苏。
复苏的步骤：
1，-80度取出冻存管握于手心，约20秒的样子投入37度水浴箱，快速摇 晃，约一分半钟全部融化。
2，细胞液快速滴入盛有6ML培养液的离心管离心。
3，将离心收集的细胞制成细胞悬液接种于培养瓶。
当时镜下看可以看到很多细胞。第二天观察培养液清亮，而且还没变黄，细胞死了很多，只剩一个一个的，都不多，我的是悬浮细胞，单个的长不好，必须成簇生长。
我细胞冻存后继续养着的细胞传了两次后也出现过死亡。当时以为是污染，但培养液是清亮的，我还是把细胞丢了。我复苏第一支的时候用的是养死细胞的那瓶培养基，但第二支我就换了一瓶培养基，但也是我同一批次配的。现在我重新买了一瓶培养基，准备把血清浓度加大点。以前是10%新生小牛血清。不知会不会活呀，真是急死了。细胞养不活什么都做不了。还请各位战友多多指教。。
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请各位师兄师姐给我看看我上面的步骤有什么问题没，谢谢。。
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redbutterfly[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你冻存细胞的步骤没有错，就我自己冻存细胞而言，
我用的冻存液的配方是1ML DMSO，9ML完全培养基（即含10%的FBS的培养基）共10ML。我每次冻存细胞时尽可能使制好的细胞悬液保持高浓度，这样复苏就算有很多死细胞，但不至于影响它的细胞密度。另外，我复苏细胞的第二天，会给细胞进行换液，去除死细胞和细胞碎片等“脏东西”，复苏了的细胞要及时观察，如果状态不好就要及时换液或做其它处理。
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发表于 2012-4-29 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你复苏时不要离心，也就是把你的步骤2省略掉。因为细胞经过冻存后很脆弱，经不起折腾。可以在细胞溶解后，用移液枪轻轻吹打混匀，然后直接一到含有培养基的培养皿中。
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发表于 2012-4-29 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“4度30min ，-20度30min，-80度保存半月复苏。”

都是裸着吗？一般放在泡沫盒子里，这样是“慢速”降温，如果是裸的，就是“急速”降温了。

复温为什么不直接投入水浴中?
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大白菜[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分析与建议：
1　细胞冻存时浓度太低，我们一般28平方厘米的细胞瓶只冻一支，而不像你分成四支；
2　细胞液快速滴入盛有6ML培养液的离心管离心？？速度太快，细胞内外渗透压变化太大，细胞容易死的，建议看一下细胞培养的细胞复苏一章，细胞加入培养基时先慢后快。
3　复苏时离心与否问题不是很大，一般复苏后六小时都要换液一次，以防DMSO对细胞的损伤作用
4　’4度30min ，-20度30min，-80度保存‘　我们是4度30－40min, -20度1.5 hours, 然后放－70度，效果也非常好，而且是祼的。没问题。如果直接把细胞放入－70或－80则需要加泡沫盒子
　一家之言，仅供参考
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2012-4-29 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的细胞死过一次，原因是期间有一个晚上停电了！
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