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标题:[求助]腺病毒

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[求助]腺病毒



我以前用AD293包装病毒,病毒是有了,但滴度太低,一直怀疑是是细胞传代太久,包装效率不高,后来我们老板搞来了一支代数较早的HEK293,可是在转染质粒时两天就出现了CPE,而且培养基变得轻度浑浊,里面有很多小颗粒,但是细胞并没有死,不知是不是污染?我们实验室条件有限,还不好拍照片。请各位高手帮帮忙,很急!
我检查过使用的培养基和试剂(单独培养了各种试剂),都没问题。不知是什么原因。我主要想了解以下问题:
1、病毒滴度不高的原因,解决办法?
2、转然后两天出现病变,是不是太快了?
3、我的细胞是不是污染了?还是细胞碎片之类的?(两次出现这种情况了)
4、收毒的时机和方法。

我的实验步骤:
1、提质粒(QIAGEN MINIprep KIT)
2、酶切,胶回收(QIAGEN MINI KIT)
3、8ug质粒,15ulLP2000转染60mmDish,之后换2%FBS的DMEM培养
4、有病变后(大于80%),反复动容三次,取上清接毒(直接加到2%FBS的培养基里,给细胞换液)

请各位高手帮忙指点,不胜感激。
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了了[使用道具]
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我发现转然后的细胞上清经0.22um滤膜过滤,接毒后还有同样情况出现。
到底是什么原因?还请有经验的同学老师帮帮忙!
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了了[使用道具]
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我的HEK293,培养三天不穿代不换液就死了,是不是跟这个也有关,细胞死时也是培养基浑浊,很多细胞脱落,变圆?
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plaa[使用道具]
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培养基浑浊可能是因为漂浮的细胞数量多,这个要根据实验的时候观察来定,一般没有污染的细胞,在镜下看到的只有细胞,没有其他杂质,如果你看到很多小黑点,那很不幸,极有可能是被污染了,根据你的描述细胞脱落变圆,我觉得倒是有点像CPE,但是CPE出现的时间是不是太早了点?我以前包装腺病毒的时候要接近一个月才能看到CPE,我不是高手,希望有更多的站友进来讨论一下,最近我要重新包装病毒
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skytree[使用道具]
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你可以用超速离心浓缩病毒提高滴度
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首先谢谢两位的建议。
因为我做实验时,我曾将疑似污染的培养基又加了些DMEM,37度摇菌,但是24小时后培养基没有混浊。所以我很疑惑。如果细胞污染了,那细菌培养应该有结果啊,细胞和病毒不会受抗生素影响,但也不会降解PS啊,所以说若污染,该细菌肯定有PS抗性,但为何细菌培养又为阴性?
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我看到的小黑点,让我自己形容的话,应该是细胞裂解后流出的胞质成分引起的(这种描述也许太主观,实在是不希望是污染)。
还有一件事,我养的HEK293,在高倍显微镜下会看到小颗粒在游动,但这种情况只出现在细胞几天不换培养基时(293长得快,一两天传代一次)或状态不好时,换了以后又不动了,我查了一下资料,有些人说使细胞代谢的正常现象(布朗运动之类的),有些说是血清的蛋白析出(灭活引起),也有人说是黑胶虫,但我发现好像对细胞没什么影响,我们实验室其他人用的HEK293都没问题,(我冻的,同一批次),我老板也说那些小颗粒不是污染,后来就没太在意过,不知跟这个有没有关系。
但我看别人的接毒细胞CPE图片都很清晰啊,一点都不混。
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misswu61[使用道具]
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小黑点有可能是“黑胶虫”,这种东西具体是什么现在还搞不清楚,一般会在细胞状态不好的情况下出现,但并不象普通染菌那样对细胞产生剧烈影响。第一次包装病毒时60mm皿转染3-4ugDNA就够了,DNA:lipo2000按1:2or1:3的量加,太多的话对细胞毒性太大,会死很多。一般7天以上出现成片的绿色荧光(如果你包的腺病毒带有GFP的话),这个时候就说明已经有病毒包装成功,并具有了感染能力了。等到细胞飘起来50%以上再收,不然滴度太小。具体包装时间会由于细胞状态,培养基营养成分以及病毒本身的状态不同而异,我见过最快的有4天就包好的。
因为包病毒需要细胞支撑的时间比较长,细胞状态一点要好,培养基的成分也要好一些,用20%的血清都不为过,并且视培基的状况可以适当每天补充一点进去,但不能换液。一旦第一轮包成功,以后就顺利了。
以上是我个人的经验,希望能有所帮助。
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谢谢你的建议,但是一般来说不是血清浓度高会影响病毒的产出吗,也许与我转染的质粒较多有关,我一般转染5-8ug,我准备再转一次。
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misswu61[使用道具]
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血清对病毒的影响我倒没听说过,你就按照一般的加10%就行了,主要是细胞状态要好,才能支撑的时间长一些,我一般10-12天收,这个时候细胞基本上全部变绿(GFP),大部分都漂起来了,不收也不行了。
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