细胞世界

非常的感谢您！
我使用I型胶原酶是因为我的致密结缔组织是由I型胶原组成，用I型胶原酶消化来获得我的细胞，使其容易自组织内部爬出；您建议在消化后使用滤网过滤，这样的目的是为了把残留的组织块剩余下来放入组织瓶内使用的，对吗？我会改进翻瓶时间，下次缩短试一下；一直用的进口塑料瓶培养；好的，我现在就是一直自己摸索做，很痛苦...也请教了几个高手看他们做，但是都和我细胞类型不同，致密结缔组织很少有人养，非常感谢您的指点，对我很有帮助！再次感谢

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呵呵，如果你使用胶原酶来消化你的细胞，那你过滤网，然后离心，或者2-3次消化，收集每次消化的细胞，加入培养基进行培养。
每次消化下来的时候，你可以离心后加入一定的培养基，取一滴滴到载波片上，镜下观察细胞数量或者进行细胞计数。这样就可避免细胞量太少而导致不成功。
进口的塑料瓶就不要用多聚赖氨酸包被了。
4个小时后翻瓶。因为按照你原来的方法，消化下来的单细胞附着在纯血清中5个小时，是否会影响其活性。

贴壁培养比较简单，你用的是消化+贴壁。如果你的结缔组织量足够多，可以多试验几种方法。1、单纯贴壁（不消化）；2、纯消化（2-3或者更多次的消化），过滤网收集细胞；3、消化+贴壁。

另外，我觉得，实验初期的不成功很常见，我们实验室的牛同志，原代做了半年，刚开始屡次不活，到后来细胞多的不可胜数，坚持下去吧。他有一次做了原代，让我们看细胞，我们劝他扔掉，因为细胞密度不到5%，然后他不扔，过了三周，全部长出来了，以后我们再也不敢说细胞少就活不了了。呵呵。

谢谢回复！
我用的是250U/ml，相当于0.2%的I型胶原酶，消化2个小时，在37度的co2孵箱内，消化后剩余很多大块的组织，这是不是代表没有消化成功呢？因为这个操作是在英文文献上查到的，他用消化2H后的组织去做原代培养，7-10天后有细胞爬出。您所说的收集上清里的细胞，那就是用了消化法是吧....我也尝试过消化法，最多用了4个小时，是不是消化的时间太短？我一直不敢用太长的时期去消化，怕造成细胞的损伤，但是昨天查了一篇最新的文献，说消化致密结缔组织可以达到10-20小时都没有问题。用胶原酶和DMEN的混合液去消化，是不是就不会对消化出来的细胞造成太大的损伤呢？再次感谢您的指点....盼回信...

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提些建议吧：
1、加大胶原酶浓度，我一般用625U/ml；
2、直接用DMEM配制，胶原酶本身对细胞的损伤就比较小，这样就可以进一步减少对细胞的损伤；
3、延长消化时间，我用625U/ml的浓度消化皮肤组织都需要2小时，你消化致密组织显然时间太短；
4、具体可以这样做：下午4点左右取材，组织剪碎，加入胶原酶，4度冰箱放置过夜（保证消化液浸透组织），第二天把组织连同消化液一起转入37度继续消化，每隔30分钟观察消化效果，同时把组织振动一下（手摇即可）以保证消化效果，一直消化到只剩小部分组织为止；过滤（可以省略），收集上清，离心（一次即可，不必过分追求离心效果，少量残余胶原酶不会影响细胞活力），收集细胞，接种培养；第二天观察，如果贴壁细胞很多，可以换液，细胞不多的话，3天换液。