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标题:[求助]MTT异常结果

8s5g[使用道具]
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[求助]MTT异常结果



各位路过大侠,救命呀,晚生最近做了几次MTT,结果各个抑制剂浓度组细胞存活率相差不大,甚至有的抑制剂组细胞0D值比阴性对照最还大,显微镜下看的时候,各个浓度组差异很明显呀,但是一测OD值就差别不大了。不太想是污染,我加MTT的时候没有出现颜色立刻变化呀。但是我有一块板子加DMSO时候,空白对照组竟然也出现了一点红色,空白对照没加细胞应该在加DMSO后为无色的溶液才对呀。
怀疑:1.细胞培养基被污染了(因为空白组没有细胞加DMSO出现了红色)。2.MTT和抑制剂发生反应了(之前做另一种抑制剂是出现同样情况,但用 PBS洗后再加MTT就好了),我把此次用的抑制剂放MTT一起后没有什么变化,所以可能性比较小。3.细胞出问题了(我的细胞培养过程中一直发现瓶子里有黑点,不动,也不影响细胞生长),可能性也不大.大侠们帮我分析一下吧。我把结果给你们看看。
<
   OD           平均值
空白  0.145   0.119   0.114   0.116   0.132   0.125
400  0.431   0.477   0.408   0.421   0.460   0.439
80  0.450   0.390   0.411   0.491   0.455   0.439
16  0.370   0.473   0.394   0.556   0.477   0.454
3.2  0.580   0.426   0.629   0.517   0.319   0.494
0.64  0.519   0.666   0.573   0.584   0.518   0.572
阴性  0.417   0.488   0.469   0.500   0.535   0.482

平常的空白对照都是0.08左右
另一块板子用的是同样浓度,结果如下:
<
   OD            平均值
空白 0.095   0.087   0.092   0.086   0.088      0.090
400   0.618   0.527   0.444   0.572   0.434   0.454   0.508
80.0   0.291   0.391   0.461   0.447   0.409   0.500   0.417
16.0   0.374   0.445   0.459   0.376   0.507   0.414   0.429
3.20 0.418   0.667   0.670   0.555   0.570   0.755   0.606
0.64   0.638   0.897   0.568   0.676   0.681   0.539   0.667
阴性 0.689   0.534   0.615   0.533   0.537   0.532   0.573
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vvmmoy[使用道具]
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请问你加入mtt后还加了抑制剂啊?我都没有加,直接吸出mtt然后加dmso就可以了吧。
我这次做忘了培养箱加水了,不知道影响会不会很大哦?
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fei1226com[使用道具]
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除了你分析的各种因素外,是否考虑过种板时是否均匀。如果竖着是一个对照组,则竖排加细胞这一排才有可比性。我刚开始做试验也经常出现阴性对照反而比抑制孔读数小的情况,若非药是具有刺激性(那就不是抑制药了)则一定是种板问题。
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moonlight45[使用道具]
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鄙人做MTT上百次,颇有心得。
发现楼主的一个小问题,细胞种的不均匀,应该报废重做。种细胞时应用枪加,每孔100微升,加的顺序为横排。吸取细胞悬液时每次枪尖插入细胞悬液的深度基本一致,细胞悬液应多配10ml,过几分钟应用移液管吸打悬液,保证均匀。每一纵列为一个加药组。
MTT孵育结束时应在显微镜下观察,欣赏一下MTT晶体的形状。如果污染细菌,可被MTT染成蓝色或黑色。加入DMSO水平摇动20分钟。再次拿到显微镜下,看MTT液滴(蓝色或黑色球状)是否完全溶解消失。若只摇5分钟可欣赏到MTT液滴。MTT液滴会严重影响OD值。
园子里MTT的资料很多,请楼主多转转,你的问题不算稀奇。
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dongdongqiang[使用道具]
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可以排除种板均匀问题,种板式随机种的,而且每个组内差异你们也看见了,差别都在0.1范围之类,园子内说在0.1范围内都是正常的。做的板子虽然不多也有二十块了,这点可以保证吧。因为没有遇到污染情况所以不敢排除污染。
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8s5g[使用道具]
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鄙人做MTT上百次,颇有心得。
发现楼主的一个小问题,细胞种的不均匀,应该报废重做。种细胞时应用枪加,每孔100微升,加的顺序为横排。吸取细胞悬液时每次枪尖插入细胞悬液的深度基本一致,细胞悬液应多配10ml,过几分钟应用移液管吸打悬液,保证均匀。每一纵列为一个加药组。
MTT孵育结束时应在显微镜下观察,欣赏一下MTT晶体的形状。如果污染细菌,可被MTT染成蓝色或黑色。加入DMSO水平摇动20分钟。再次拿到显微镜下,看MTT液滴(蓝色或黑色球状)是否完全溶解消失。若只摇5分钟可欣赏到MTT液滴。MTT液滴会严重影响OD值。
群里MTT的资料很多,请楼主多转转,你的问题不算稀奇。

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有点不太明白的,看过好多次别人介绍心得,都是横排加细胞,竖排加药,这是为何呢?为何不是竖排加细胞并竖排加药,这样同组之间不是更有可比性吗?
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zhenxin[使用道具]
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相隔时间长了细胞密度容易变化,(细胞在细胞悬液中一直在下沉),这种加法可保证各列之间细胞密度一致。
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jrwyyplt[使用道具]
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我是左手拿吸管吹,右手拿枪加细胞悬液。加一个孔,吹几次。发现蛮均匀的呀。跟一个博士学的
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redbutterfly[使用道具]
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加一块板只需吸打2-3次,否则有些种类的细胞存活率会降低。
要充分利用显微镜,每一步骤都可以观察。我教了20多个师弟师妹,做MTT很快就做得很好。
要相信多数人的相同做法是正确的,可在园子里多转转。
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kuaizige[使用道具]
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弱弱问一下:
在MTT孵育结束后,有些细胞状态不是很好,脱落了
如此一来将MTT吸出时,眼睁睁的看着吧紫色物质也一并吸出了~~
请问这个问题您是怎么解决的啊?~
将板子3000rpm离心10分钟也不管用~~

还有,看园子里有的人说加MTT前要吸出培养液,有的人说不用吸出培养液~~
到底那种方法才是正确的呢~~
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