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标题:[求助]3T3-L1细胞 分化液配制问题

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发表于 2012-5-7 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]3T3-L1细胞 分化液配制问题




一个人做实验 没什么经验 很多疑问 希望高手指导！！

分化液里面的胰岛素干粉是小鼠的胰岛素 还是人的胰岛素？哪里的胰岛素干粉好些？我问了下这个胰岛素很贵，是我问的不对还是本身胰岛素干粉就是很贵？
配制100ml的分化液 IBMX Insulin Dexamethasone 各需要多少g?我用的培养液是90%高糖DMEM 和10%胎牛血清

请明人指点
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发表于 2012-5-7 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胰岛素不贵啊，25mg包装的，也就200－300元吧，是人胰岛素，其用量文献里不太一样，我们是称取10mg的胰岛素，溶于10ml的培养液中，过滤，可存放1个月，用时第一次诱导是1ml培养液加10微升该胰岛素溶液。
MIX都是现用现配，你一次性配那么多干什么呢，而且这个试剂比较贵滴说，一般是称取11.11mg的MIX，溶于400微升的DMSO里，必须现用现配。
用时每1ml培养液加10微升。地塞米松是100微升加入到9,9ml的培养液中，过滤并但也只能存放一个月
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8964357[使用道具]
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发表于 2012-5-7 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

今天刚配了地米和胰岛素。胰岛素在培养液里可以直接融的吗？我用36%盐酸溶的。差不多也是10毫升水加17微升盐酸，用时1ml培养液加1微升该胰岛素溶液。地米是粉剂，用100%无水乙醇配置，这两个长期保存都是-20可以的，4度短期。IBMX现用现配。
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c86v[使用道具]
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发表于 2012-5-7 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
3T3-L1 Differentiation Protocol

MATERIALS
Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)
Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)
Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEM
Isobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)
Dexamethasone (Sigma D-4902)
Insulin (Bovine; Sigma I-5500)
MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)
Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)

SOLUTIONS
10% Calf Serum/DMEM

60mL Calf Serum
6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate
6mL 100x P/S/G
500mL DMEM
10% FBS/DMEM

60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)
6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate
6mL 100x P/S/G
500mL DMEM

IBMX Solution (make fresh)
a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.
b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.
Insulin Stock Solution
167 uM (1mg/mL) in 0.02M HCl
Filter sterilized through 0.22 mm filter
Can store at -20C for long term, 4C short term.

Dexamethasone Stock Solutions

Freezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)
Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBS
Filter sterilize and store at 4C.
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发表于 2012-5-7 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)

To required volume of 10% FBS/DMEM add:
1:100 IBMX
1:1000 Insulin
1:1000 Dexamethasone working stock

Insulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)

To required volume of 10% FBS/DMEM add:
1:1000 Insulin
METHOD
Preadipocyte maintenance and passage:
We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.
Adipocyte Differentiation Protocol:
1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM
2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.
3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The media will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.
4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10% FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.

以上是以前的一个版友提供的，方法比较完备，按照上面的培养应该没什么问题。3T3－L1是需要精心照顾才能好好分化的细胞，分化周期比较长，要有耐心啊！胰岛素我记得我用的是牛的（sigma），应该问题不大。
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发表于 2012-5-7 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胰岛素不贵，25毫克，100多元，我正准备样3T3L1细胞，以后多交流啊
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发表于 2012-5-7 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是的，我就是用上面的方法养的，个人感觉不错。细胞开始分化后会贴壁不牢，换液时需小心一点。
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8964357[使用道具]
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发表于 2012-5-7 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的回复！请问大家养脂肪细胞细胞测指标都是按怎样的步骤呢？在没有确定药物是否有作用和药物浓度的情况下，先检测RT-PCR，再WESTERN,再测脂质，再油红O吗？
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