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标题:[求助]关于细胞计数法绘制生长曲线的困惑

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[求助]关于细胞计数法绘制生长曲线的困惑




最近开始养肿瘤细胞,想测一下细胞的生长曲线,在园子里搜了一下,好多人用MTT法,由于条件有限,我打算用细胞计数法来做。
看了以前一位师兄的论文,他使用6孔板做的,每组细胞做3个复孔,接种前胎盘蓝计数活细胞,初浓度5000个/孔,加2ml生长液,分别培养24、48、72、96小时消化细胞并计数。
现在我的困惑是我应该准备多少快板?我只养一种细胞,每个时间点一个板吗?会不会太浪费?一块板计2个时间点,操作的过程中会不会污染啊?师兄的那个初浓度合适吗?按照最初的接种浓度一直养下去,到了规定的时间收细胞来计数是吗?我在瓶中养的细胞长的很快,隔一天就要传一代,那么在板中培养的过程中要换液吗?计数后的细胞怎么处理啊?由于刚开始养细胞,有诸多问题要请教,希望各位师兄师姐多赐教!谢谢!
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summerxx[使用道具]
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先看看司徒镇强的《细胞培养》上关于细胞生长曲线的介绍吧。


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summerxx[使用道具]
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summerxx[使用道具]
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生长曲线图:


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+小生怕怕+[使用道具]
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书上讲的是理论,但没有说具体的做法,理论和实践是有一定差距的。况且每个人的做法不同,我们没有老师指点,也没看师兄师姐做过,全靠自己摸索,耗时耗力,还是请前辈们多告诉我们初学者一些实践经验,少走弯路,谢谢!不胜感激!
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我也是新手,今天刚听了一个同学给讲了下细胞计数,把其中能对你有所帮助的说一下:
1.我们这里计数一般用24孔板,一个就够了,每个时间点测三个孔取平均值,一共8个时间点。
2.至于初始浓度我也不知道多大合适。
3.从接种开始,其他孔的细胞一直养,每次计数时,其他孔就换相同量的培养基,计数后的细胞就直接扔掉了,如果自己有保存的话,我感觉。
希望对你能有所帮助~
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yhz1973[使用道具]
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细胞计数法做生长曲线用六孔板是可以的,每组3个复孔,每24h消化一组做细胞计数。
将两个时间点做在一个板上也没问题,只要你的操作过关是不会污染的。你也可以使用直径3.5cm的培养皿,他们与六孔板的孔大小是相同的,这样你就可以每次消化3个培养皿,分开操作。
关于细胞接种的初浓度,这要根据你的细胞生长速度以及你做生长曲线的时长来决定。最理想的是像popestudy发的那张图一样,呈一个S型的曲线。细胞接种的过密会使细胞过早的进入生长抑制期,接种的过稀会使细胞生长过缓,潜伏期过长,不能达到对数生长期,所以你需要摸一下条件。
关于换液问题,正常情况下在第48h或72h换液一次就可以了,但要小心不要把细胞冲掉了。
另外,细胞在计数后直接扔掉就可以了。如果你的细胞很珍贵,也可以回收,只要保证在计数的时候细胞不被污染可以接种到培养瓶中继续培养。
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dragonkilly[使用道具]
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我也是新手,今天刚听了一个同学给讲了下细胞计数,把其中能对你有所帮助的说一下:
1.我们这里计数一般用24孔板,一个就够了,每个时间点测三个孔取平均值,一共8个时间点。
2.至于初始浓度我也不知道多大合适。
3.从接种开始,其他孔的细胞一直养,每次计数时,其他孔就换相同量的培养基,计数后的细胞就直接扔掉了,如果自己有保存的话,我感觉。
希望对你能有所帮助~

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我现在也在用这种方法做生长曲线,但是用0.25%的胰酶消化后,用血细胞计数板无法读出细胞数,九个大格里总共只有几个细胞,而且细胞的形态不规则,不是圆形。但是消化之前观察发现,24孔板中的细胞汇合度可达70%。
不知道这是什么问题,会不会是胰酶的问题?或者还有别的需要注意的地方?恳请高人指点。
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plaa[使用道具]
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我也是刚做,起初接种密度是10的4次方,然后姨酶消化的时候又用PBS稀释了一倍,所以头3天在血球计数板里只能看到一两个细胞或者根本看不到细胞。我当时以为是自己技术问题,后来才想明白是因为密度太低了,10的4次方以下根本就在计数板上只能观察到个位数的细胞,假如再有小小的误差的话,可能就看不到了。后来在第5天,我看孔里都铺满了的时候再计数,就很乐观了,4个方格里的细胞数目很均匀,都是12个左右,所以就证实我前边的猜测是对的。现在我打算用MTT来做曲线,但是听说MTT变异很大,且经常和细胞计数辅助来进行细胞曲线。所以我不知道群里有哪位大虾能够指点一下10的4次方及以下浓度的用什么方法计数比较好?
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