[求助]细胞怎么不长呢？

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标题:[求助]细胞怎么不长呢？

u234[使用道具]
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发表于 2012-5-7 17:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位，我养的细胞怎么老是死不死、活不活，不见怎么长呢？
养的是肾脏细胞，用的培养基是60% DMEM-LG (Life Technologies-BRL, Grand Island, NY), 40% MCDB-201 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1*insulin-transferrin-selenium, LA-BSA 1 mg/ml (Sigma), 0.05 uM dexamethasone (Sigma) and 0.1 mM ascorbicacid 2-phosphate (Sigma), 100 U penicillin and 1000 U streptomycin (Life Technologies) with 2% FCS (Hyclone Laboratories, Logan, UT), 10ng/ml EGF, 10 ng/ml PDGF-BB, and 10 ng/ml leukemia inhibitory factor。
组织块种植，十几天了，只有一处有细胞爬出，但又过去几天了，这一处细胞也没有明显扩增。按照每平方厘米10的5次方个细胞种植，一个周了，还是稀稀拉拉的，只有瓶边上几处融合，总的来说细胞长得太慢。根本没法进行下一步试验。
请各位帮我分析分析可能的原因，我把长得不好的照片传上来了，请各位大哥大姐帮帮忙,救救急。

u234[使用道具]
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发表于 2012-5-7 17:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是照片

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u234[使用道具]
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发表于 2012-5-7 17:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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2012-5-7 17:59

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kulee[使用道具]
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发表于 2012-5-7 18:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

感觉像支原体污染，特别是最后一张。

在支原体污染的后期，有胞内空泡的出现。

fei1226com[使用道具]
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发表于 2012-5-7 18:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有可以治疗的抗生素，

你最好用氨基酸分析柱检测一下培养液里的瓜氨酸水平，如果能检出基本可以肯定是支原体污染

支原体，使精氨酸在精氨酸脱亚胺酶的作用下变为瓜氨酸。

u234[使用道具]
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发表于 2012-5-7 18:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的骨髓瘤细胞镜下看也有很多小点点，仔细看就是小泡。很多，我以为是吹细胞时的泡沫，这么说是支原体么？一定是么？
还有没有别的特征？

kswl870[使用道具]
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发表于 2012-5-7 18:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

支原体在显微镜下是无法看见的，只有通过检测才能确定，可通过PCR或染色等，楼上说的也是一种办法

owanaka[使用道具]
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发表于 2012-5-7 18:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我养的肾脏细胞前天也出现了这种情况，感觉细胞没以前长得快，而且悬浮细胞比以前稍多，心里非常担心是污染，先养着观察下再说

xyw5[使用道具]
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发表于 2012-5-7 18:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光镜下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在分布鱼细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。
支原体代谢需要固醇类物质，部分种类需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一种支原体都有自身特点。多数支原体适合于偏碱条件下生存（pH7.6-8.0）。对酸耐受性差，对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。
【防治】
1 根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放置在41℃作用5-10h，最长不超过18h，以杀灭支原体。但如此高温度对细胞的生长也有很大影响，因而在实验前应先用少量细胞做试验以找出最合适的时间和温度，以尽可能保证既杀灭支原体又使细胞不致受到太大损伤。
2 动物体内接种：将受支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。
目前已有能滤除支原体的新型滤膜系统，可以去除受污染培养用液中的支原体，但不能去除附在细胞上的支原体。

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-5-7 18:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上群友直接把司徒镇强书上的原话给搬过来，呵呵，具体的实验和理论是两码事情，不能死板教条啊。
的确，支原体是对温度比较敏感，但是，你要考虑楼主他现在做的是原代哦，现在是细胞最脆弱的时候，单纯的提高温度来杀死支原体，只会雪上加霜，细胞肯定会死的更快。
动物体内接种这种方法在这里根本不可行，一般这种方法是用于单克隆的纯化时候或者是用于可接种肿瘤的时候才能用的，楼主现在在做原代，这种方法根本没有用的，呵呵。
原代培养是比较难的，一两次做成功的几率较小，多练，多做吧，实在不行再做一次吧，适当的将接种密度提高一点吧。
祝你成功！

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