[求助]细胞周期测定方法

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标题:[求助]细胞周期测定方法

蒲公英[使用道具]
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发表于 2012-5-8 14:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是我测定小鼠脾细胞周期的实验结果分析过程，由于没有专门的流式细胞仪老师，所以只能自己测定分析，在测定中遇到了一些问题，希望高手予以指点
实验步骤大致就是取脾，制成单细胞悬液，离心弃上清，加红细胞裂解液，离心弃上清，PBS洗一次，70%乙醇固定过夜，然后离心弃乙醇，PBS洗一次，加PI染液和RNase，4度避光染色30min后测定。
分析过程如下：
设定的第一个门 FSC/SSC

附件

2012-5-8 14:55

83864363.jpg (12.65 KB)

蒲公英[使用道具]
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发表于 2012-5-8 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

设定的第二个门 FL2-W/FL2-A

附件

2012-5-8 14:57

19534194.jpg (17.94 KB)

蒲公英[使用道具]
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发表于 2012-5-8 14:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是获取的图，细胞数为20000

附件

2012-5-8 14:58

28332010.jpg (11.08 KB)

蒲公英[使用道具]
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发表于 2012-5-8 15:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

采用自动分析结果如下：

File analyzed: Data.009
Date analyzed: 5-Nov-2008
Model: 1DA0n_DSF
Analysis type: Automatic analysis

Diploid: 100.00 %
Dip G1: 94.41 % at 39.65
Dip G2: 3.73 % at 78.10
Dip S: 1.86 % G2/G1: 1.97
%CV: 4.00

Total S-Phase: 1.86 %
Total B.A.D.: 1.39 %

Debris: 0.11 %
Aggregates: 3.32 %
Modeled events: 17404
All cycle events: 16806
Cycle events per channel: 426
RCS: 3.950

从数据中可以看出S期没有激活，静止期较大占到94.41%，我重复做了几次都是这个结果，我不知道正常情况下，小鼠的脾细胞就是这样的吗？在实验中我设了两个门，第一个门好像用处不是很大，而第二个门如果移动一点就会使图形发生较大变化，我不知道我上面的设门方法是否正确，如果不正确应该如何设门，这个说明什么意思，为什么需要这样设定，谢谢流式细胞仪老师的指点，万分感激！！

dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-5-8 15:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们都是只设置第一个门，第二门的图其实就是和你分析的第三幅图是一样的，只不过一个是散点图一个是直方图，所以你只要第三幅图就可以了，第三幅分析R1里面的，第二张图可以省略

fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-5-8 15:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

其实最重要是第二个门
楼主的第二个门设置的有些问题
图形应该不是这样的
见图示，应该把图形调整成这样
让debris和single cells和aggregates分开
把门圈住single cells
可通过调整Fl2-H电压和FL2-W的Amp Gain来实现

附件

2012-5-8 15:05

66493219.jpg (48.34 KB)

star#room[使用道具]
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发表于 2012-5-8 15:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得第二个门是很重要的，第一个门也许可以省略但第二个门是不能省的，因为是要去除粘连细胞，象楼上这个图做得很标准，但我在实际操作中，单细胞和粘连细胞就没有分的那么开，我也调整了FL2-H电压和 FL2-W（楼上的FL2-W amp gain也是在电压那个对话框里调吧）但结果和楼上的图还是有差别，所以我想通过设门只划定单细胞来实现，结果就是我做的那样，如果门太靠左，那么自动分析结果中 RCS就会大于5，结果可能就不太可靠了。是不是新鲜组织细胞悬液和培养细胞做出来的结果有所不同呢？希望大家能多发些图上来，让我看看别人做出来的是什么样的？都是那么标准吗？我今天回去后再做做，看看能不能出现楼上图的效果。

vera+[使用道具]
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发表于 2012-5-8 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你第一幅图中的ssc的电压太高了，脾细胞比较杂，最好搞清楚你研究的是其中的那一群细胞，比如最重要的是淋巴细胞，分离一下再测效果好。
其次，由于SSC电压高，所以第二幅图形成不了楼上所给的那样的竖着一条的单个细胞的群。

蒲公英[使用道具]
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发表于 2012-5-8 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也考虑到了脾细胞比较复杂，所以同时也做了胸腺的，但结果是一样的，S期也是没有激活。另外楼上提到我的SSC电压太高了，我没有注意到，我准备再做一做，看看能不能有所突破。希望能多看到一些做过的图，我可以学习参考一下，谢谢群友们。

dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-5-8 15:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，你第一幅图中的ssc的电压太高了，脾细胞比较杂，最好搞清楚你研究的是其中的那一群细胞，比如最重要的是淋巴细胞，分离一下再测效果好。
其次，由于SSC电压高，所以第二幅图形成不了楼上所给的那样的竖着一条的单个细胞的群。

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不存在SSC太高的问题，倒是FSC小了，正常细胞（偏右的一群）和凋亡以及死细胞（偏左的一群）没有拉开。楼主应该gate在右边一群。

而且即使SSC高了，也不会出现viennie所说的第二幅图的问题。

另外，楼主的细胞粘连太厉害，乙醇固定时是一边vortex一边加的吗？

下面是我N年前做的图，应该是胸腺细胞，记不清了。一个是正常组，一个是实验组观察某药物对细胞凋亡的影响。现在看FSC 也应该再加大点。

附件

2012-5-8 15:18

34543891.snap.jpg (37 KB)

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