[求助]western 遇到了难题，条带异常

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标题:[求助]western 遇到了难题，条带异常

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发表于 2012-5-10 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这几天做western条带出现了奇怪的现象。
band变成空心了，还有actin条带像PCR一样拉长了，请各位能人帮忙，指点谜径。

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2012-5-10 15:08

89567925.jpg (5.81 KB)

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发表于 2012-5-10 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是actin，我这是用细胞，分细胞质里的蛋白和细胞核里的蛋白做了western blot。细胞质里的蛋白actin就变成这样了，细胞核里的actin就正常。是不是我分得不对了就出现这种情况？我用RIPA buffer 提取蛋白的。

附件

2012-5-10 15:08

23218528.jpg (7.68 KB)

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发表于 2012-5-10 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这是核里的actin。算挺正常吧

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2012-5-10 15:09

36127288.jpg (5.54 KB)

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发表于 2012-5-10 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在这儿写出我做western的条件，有什么该优化的地方，希望大家帮我指出来。

1. 上样一般30 ug蛋白, volume一般不超过3ul。
2. 电泳 stacking gel 70V, 分离胶100~120V。
3. 转膜 100V 1h。
4. 封闭　5% 脱脂牛奶 2h。
5. 凡washing TBST 　7~10min／次，三次。
6. 一抗　1:1000, 4 ℃, overnight (一般15~17小时)。
7. 二抗　1:1000~2000, 室温 1h。
8. ECL 用pipet反复滴在膜上约3min。
9. 曝光　在暗盒里10秒～3分钟不等，因样品而异。

什么问题会导致上面的那些条带呢？？？　
毕业在即，心急如焚，望各位前辈高人不吝赐教。

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-5-10 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你那个空心的条带是蛋白过多曝光过强了，减少曝光时间就好了，这么强用胶片贴一下就好了，或者你少上点样啊，至于那个拖的现象，你确定你的抗体以前从来没出现过这种情况吗，会不会抗体的问题呢，还有就是会不会跑太久，分得太开了呢

fsdd817[使用道具]
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发表于 2012-5-10 15:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上样量太高了，边上孔的蛋白有溢出的现象。
还有空心的条带是压片时间久了，要么换个弱显试剂盒，要么缩短压片时间。

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发表于 2012-5-10 15:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

非常感谢楼上两位，我电泳跑的时间是长了点，一共加起来可能有俩小时了，我以为条带分得越开就越好呢，这会是条带拖下来的原因吗？

再附上片子。这次我上样减量了，封闭时间长了点，4摄氏度里过夜十五个小时，空心现象减轻多了，fraction之后cytosol里的Actin也是好点了，就是条带托下来的现象还有，我再试一下减跑电泳时间。我压片只有7，8秒啊，这还长吗？我怕在短了压得太模糊了。
对了，我洒上ECL PLUS之后，有时候membrane上开灯的时候就隐约可见淡黄色的条带的痕迹，这种现象是否正常呢，不影响条带的质量？

罗罗嗦嗦写这么多，只不过是想给同道中人提供点参考，还有请大家多多指点。

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发表于 2012-5-10 15:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从上至下依次是cytosol,nuclear,actin条带。
nuclear拖下来的现象比cytosol的好多了，这是什么原因呢？

附件

2012-5-10 15:20

36101337.snap.jpg (13.35 KB)

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发表于 2012-5-10 15:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

洒上ECL PLUS之后，有时候membrane上开灯的时候就隐约可见淡黄色的条带的痕迹，这是正常现象，蛋白量多，条带很强的时候就会出现这种现象的，你应该很高兴，这样就代表你曝光的时间应该短一点，像你的七八秒其实也差不多了，试一下二三秒吧，应该也能曝出来

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发表于 2012-5-10 15:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

遇到western的问题，打入关键词搜索，竟然点击进入了自己的问题，发现一年前的问题没有圆满解决，所以告诉大家结局。
后来这个问题解决了，原来是5X的sample buffer有问题，不知道buffer有什么问题，反正重新配置后就没事儿了。