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标题:[求助]流式测细胞周期

伊莎贝拉[使用道具]
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[求助]流式测细胞周期



常规的PI染色,肿瘤细胞株,机器是FACS Aria,做出来图是这样:


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伊莎贝拉[使用道具]
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用ModFit分析,G2/G1为2的话,G2/M的值就为0,而且CV要设10才能把峰填满,怎么回事呢?


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loli[使用道具]
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请问你是不是固定了很长时间?如果固定时间长,就会出现这种图形,不规则,CV值过大
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伊莎贝拉[使用道具]
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谢谢,是的我是固定过夜甚至更久,因为想集中标本一起做。请问多久合适呢?4度还是负20?
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loli[使用道具]
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4度固定即可,总之固定的时间越长会越不好,其实固定一周就会成你这种情况,建议不要超过3天吧,如有条件固定半小时后上机
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131415[使用道具]
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固定过夜,4度保存,一个月内测即可。估计是前期处理的不好,可参考[临床流式细胞分析]一书
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qqq111[使用道具]
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固定时间不是主要原因,只要不超过一个月都行。4度或负20都可以的。
你这结果分析出来CV值和 RCS值肯定很大,结果不可信。
另外用ModFit分析,G2/G1一般调到1.9,2.0是理想值。
问题的原因是样品制备的不好,或一开始的细胞状态不好。具体的制样方法网上很多的,要点就是将细胞制成单细胞悬液。
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loli[使用道具]
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我认为固定是有一定原因,大家可做个测试就明白了,同一株细胞分别固定半小时,一天,一周看看就知道了
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abc816[使用道具]
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先拿你的样品用其他流式机型测一下,也许结果会好很多哦。

如果你是用FACSCanto、FACSCalibur、LSRII等机型测出这样的图,只能说是样品制备的问题,但用FACSAria测的,就不能把问题单单归结到样品上了。

FACSAria是新机型,激光形状跟以往的仪器都不一样,光斑是狭长的9umx81 um,对大于9 um的细胞进行狭缝扫描(slit scan),分辨率高,能做到11荧光,13参数。但这样的激光几何形状的改进,也给这一机型带来了弊病,就是不适合DNA分析。因为,DNA含量分析要收集一个细胞的所有DNA信号(面积)。当细胞较大时,slit scan获得的DNA信号不完全,有一部分信号会丢失,而通常G2/M期的细胞最大,所以这个期的细胞信号丢失最多,以致于无法看到明显的G2/M峰。而且不能有效gate掉聚集的细胞(aggregate),G0/G1峰的CV值也会变大。而其它机型的激光是椭圆形的,光斑远远大于细胞,所以不存在这一问题。

虽然FACSAria在检测DNA含量方面看起来有点先天不足,但还是可以通过降低液压、流速,调整alignment等有所改进,要看操作员的本事了,据说有人也能做出比较标准的图形。

我想这样品不是你自己测的吧,如果是别人操作的,你让他show一下给别人做的图,如果很漂亮,说明这人已经很牛了,那还是你的样品的问题,呵呵。

Anyway,用FACSAria测细胞周期是给自己找麻烦呢。
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伊莎贝拉[使用道具]
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谢谢,大家的关注。自己总结一下:1. 确实不是固定的原因,我已做了比较。2. ACSAria的因素,操作的老师可以做出比较标准的图形。3. 样品制备,我还不太确定哪一步的问题,请大家继续讨论。
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