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标题:[求助]为什么病毒转染悬浮细胞老出问题

ffooll[使用道具]
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发表于 2012-5-12 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]为什么病毒转染悬浮细胞老出问题




目前在做悬浮肿瘤细胞的病毒感染（吉凯订购）。用阴性带荧光片段的病毒颗粒感染悬浮细胞检测转染效率，可是即便是空病毒，感染的效率也极低，外加细胞本身生长很快，所以结果总是不理想。
因为最后想得到稳定转染的细胞，希望能得到高手的指教。。。
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发表于 2012-5-12 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 先确定一下你的病毒滴度是否过低,用比较容易转染的293T先测定一下.
2 悬浮细胞比较难转,你可以先少分一些细胞,我们一般先分到24孔板里转染,这样比较节
约病毒,而且还可以适当增加转染病毒的量,待转染成功后再扩增细胞.
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发表于 2012-5-12 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是打算用293细胞测定病毒滴度，而且我本身是用96空板种10^3的细胞感染的，主要问题是转进去的病毒荧光不亮，而且随着等待的时间延长，未转进病毒的细胞增殖太快，导致最后的转染效率很难估计
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发表于 2012-5-12 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的什么细胞?在没有加病毒的时候也增殖的很快么?
你可以询问一下公司他们浓缩病毒的方式,有些浓缩方式会将培液里的血清蛋白一起浓缩,造成加病毒以后刺激细胞的生长.如果是这个原因的话,我们是采取在加病毒5小时后就换液,但是你96孔板的细胞太少,不知道能不能离心下来换液,有离板机的话比较方便.
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发表于 2012-5-12 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我这种肿瘤细胞的增殖本身就是很快的，但是病毒感染后的3天一般荧光都不是很明显，但是继续等待的话，96孔板的细胞就已经满了
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发表于 2012-5-12 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呃,那就要从病毒本身找问题了.是哪种病毒?慢病毒么?
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发表于 2012-5-12 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

而且一位师兄在introvigen订购的病毒颗粒感染类似的肿瘤细胞，感染率很高，而且发光的等待时间很短。并且我加入病毒后，细胞死亡的并不多，即便是POLYBRENE的孔也是这样。到底应该细胞什么状态下换液呢？
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发表于 2012-5-12 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是慢病毒
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guagua[使用道具]
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发表于 2012-5-12 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最大的可能还是病毒滴度不够了.
换液和细胞的状态其实关系不大,慢病毒如果滴度够的话,4-5个小时就可以换液了,24小时就可以看到明显的荧光.尤其是空载体,有目的基因的可能会慢一些.
国内的公司包装的病毒我是不太敢相信的,现在捣浆糊的公司太多了.
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发表于 2012-5-12 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

慢病毒转染效率与细胞种类、病毒的MOI值以及转染时间有关。
1、细胞种类：一般来说，肿瘤细胞系比原代细胞要好转染一些；
2、MOI值：与上相同， 不同的细胞，慢病毒的MOI值也不一样，例如吉凯的慢病毒，转染Hela的MOI值是1，而转染原代DC细胞的MOI则要接近100；
3、转染时间：加入病毒液的时间长短与转染效率有很大关系，且与细胞种类也有关；一般来说，加入病毒液的时间越长，转染效率就越高，但加入病毒液的时间过长，则对细胞的损伤就会过大，造成细胞死亡太多。
建议：
1、设置不同的梯度，摸索最适合的MOI值和转染时间，我们设的是MOI=5、10、15、20（如果MOI大于20，一般就要加入Polybrene了，终浓度为10μg/ml）；转染时间＝4h、6h、8h、12h和24h；
2、细胞的接种密度不要太大，亦不要太小，一般在细胞融合到70％即可进行转染了；还有就是细胞本身的状态对于病毒的转染效率有很大的关系，如果细胞的状态不好，那么就不要勉强做转染，可以再培养1、2天再做；
3、做转染时，病毒液不要用含血清浓度太高的培养基稀释，我们用2~5%的FBS。
祝楼主好运。
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