细胞世界

有关细胞技术的热门话题——H3、32P和I125标记法

H3-胸腺嘧啶核苷掺入法 (H3-TdR) 相关问题总结


1. 原理：

（1）H3-TdR掺入法检测淋巴细胞LDL-R的活性：细胞分裂增殖所需的大量胆固醇主要通过内源性胆固醇合成，以及加速细胞膜LDL-R介导的特异性结合，摄取血LDL中的外源性胆固醇而获得，当用mevinolin(胆固醇合成的限速酶HMG-CoA还原酶的抑制剂)阻断细胞内源性胆固醇的合成，并使细胞外环境中LDL浓度降低至无非特异性外源胆固醇摄取时，细胞分裂生长完全取决与细胞膜表面LDL-R活性，掺入3H-TdR量与细胞生长成正比例关系
（2）H3-TdR掺入法检测细胞增殖：细胞发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H -TdR），可被细胞摄入而掺入DNA中，测定3H -TdR的掺入量，可判定细胞的增殖程度。

2. 细胞的收集（操作方法）：

(1)3－H掺入闪烁瓶计数法
(2)手工收集的过程

3. 放射核素的防护：

(1)香港特别行政区政府 卫生署 放射卫生部 相关文件
(2)3H-TdR放射性危险有多大

请教防止或减少同位素危害的方法 by 实验区综合信息交流版

4. H3-TdR的购买：

(1)混合淋巴细胞反应实验中所用的丝裂霉素及3H－TdR在哪购买
(2)上海原子核研究所(cuturl('www.sinap.ac.cn'))

5. 3H-TdR的孵育时间：

(1)混合淋巴细胞反应什么时候开始加3H-TdR
(2)我们用3H-TdR检测牛LEC增殖是每孔分别加入3H-TdR（其放射比活性为3.7^104 Bq/孔）孵育12h。
(3)在细胞分裂周期中只有S期合成DNA，故应在S期加入3H-TdR，加入过早不但不被细胞摄取，反而被降解为胸腺嘧啶，不能作为合成DNA的原料。一般在培养终止前6或16h加入3H-TdR，其掺入量高。

6. 相关资料：

(1)细胞培养示踪术 幻灯
(2)采用3H-TdR掺入率测定淋巴细胞增殖活性 1
采用3H-TdR掺入率测定淋巴细胞增殖活性 2
淋巴细胞转化试验(3H-TdR掺入法) 第3-4页
(3)用3H-TdR标记的细菌在动物体内的放射性强度测定
(4)3H-TdR用于DNA修复合成试验 1
3H-TdR用于DNA修复合成试验 2

7. 3H－TdR与MTT、BrdU的区别：

(1)3H－TdR与MTT真有区别吗
(2)MTT法与3H-TdR法有何优劣
(3)3H－胸腺嘧啶与MTT有何区别
(4)BrdU标记和H3-TdR标记的比较

8.讨论：

(1)cpm如何转换为每分钟3H-TdR吸收量（pmol／1x106 cell）
(2)闪烁液的配置（POPOP的用量0.1-0.5均可？）
A. 闪烁液PPO（2,5-二苯基异噁唑）5.0g，POPOP［1,4-双（5-苯基噁唑基-2）苯］0.3g，无水乙醇200ml及甲苯800ml混匀即可
B. ppo5g popop，0.1～0.3g 加二甲苯或甲苯至1L；POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加 PPO，然后补足二甲苯。配好的闪烁液需要闭光。
C. 将0.5g POPOP溶于1000ml二甲苯中，充分溶解后加入5g PPO，充分溶解后避光保存。
D. 均相法 PPO 4g popop 0.1g 纸片法 PPO 5.5g popop 0.1g
（3）测细胞毒试验能用3H－TDR渗入法吗

敬请广大群友指正、补充。谢谢！

附上《现代药理实验方法》一章节：同位素液闪测定
再附上 放射性防护（32P），近期将继续完善该帖，增加常用核素的实验知识
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6962766')

H3-胸腺嘧啶核苷掺入法 (H3-TdR) 相关问题总结
8.讨论：

(1)cpm如何转换为每分钟3H-TdR吸收量（pmol／1x106 cell）
(2)闪烁液的配置（POPOP的用量0.1-0.5均可？）
A. 闪烁液PPO（2,5-二苯基异噁唑）5.0g，POPOP［1,4-双（5-苯基噁唑基-2）苯］0.3g，无水乙醇200ml及甲苯800ml混匀即可
B. ppo5g popop，0.1～0.3g 加二甲苯或甲苯至1L；POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加 PPO，然后补足二甲苯。配好的闪烁液需要闭光。
C. 将0.5g POPOP溶于1000ml二甲苯中，充分溶解后加入5g PPO，充分溶解后避光保存。
D. 均相法 PPO 4g popop 0.1g 纸片法 PPO 5.5g popop 0.1g

敬请广大群友指正、补充。谢谢！

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先扔块砖头，坐在沙发上等玉。
1. cpm如何转换为每分钟3H-TdR吸收量（pmol／1x106 cell）
没用过，但知道现在的液闪仪可以测dpm，如果用同批3H-TdR（各批次的比活度会有差异）定标（相当于标准曲线），用dpm检测程序可以直接测得浓度，而不是用cpm换算。
比活度——3H（居里）/Tdr（摩尔）。
在实际应用中，此指标很重要，因为过多的同位素掺入会导致细胞的死亡，而死亡的细胞在收集时将被洗掉。所以，如果是高增殖的细胞，应选用比活度低的（也可自己用Tdr稀释）；反之则需用高比活度的，可提高检测的敏感性。
2. 闪烁液（液态闪烁体）原本就有不同的配方，根据待测样本中同位素的含量而选用，可提高检测的敏感性。现在大多用商品化的闪烁液，但还是需注意在整个实验中必须用同一型号的闪烁液。

我在做肌肉卫星细胞的培养，哪种检验细胞增殖的方法较好啊？想听听您的意见啊！

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选择检验方法，还需根据你的实验条件，技术力量等因素而定。

我们老师说每次实验只有4个毫居里，他意思是危害性极小是么？3H在滤纸上烘干的时候会不会挥发啊

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浓度小也要注意啊，毕竟是核素，要保证不直接接触
只看到书上写I－125会挥发，没见何处说3H会挥发，否则该方法就行不通了，实验证明是可行的