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一、先做surface marker的染色，如CD3,CD4,CD25之类的（protocol简述如下）
1、收获细胞，0.5-1x10e6/tube，用FACS Buffer 2ml洗涤一次，倾倒后滤纸吸干管口液体
2、加入预先配置好的你需要染的surface marker的抗体混合液(即CD3,CD4,CD25抗体mixture）,充分混匀，室温下孵育20分钟
3、FACS Buffer 2 ml洗涤一次倾倒后滤纸吸干管口液体
二、以下进入Intracellular Staining的步骤
1、加入Fix/permeabilizatioin Buffer（不同公司有各自的试剂，ebioscience或者BD，看你的抗体是那个公司的，但是操作流程大致相同）我个人经验FOXP3和IL-17抗体都是ebioscience的比较好。
2、加入Fix/Perm Buffer 250ul 后，混匀，4度孵育30分钟（公司可能推荐1ml，我一直加250ul，绝对可行）
3、用公司配套的Perm Wash Buffer 1x的 2ml洗涤1-2次，本人一直洗一次节约试剂，也没有问题
4、如果有Isotype染色的，需要加Normal Rat Serum 4ul 进行blocking，混匀，室温下孵育15分钟
5、如果不做Isotype，第4步可以省略
6、不必洗涤，直接加入FOXP3抗体和IL-17抗体，室温下孵育30-60分钟，我建议是60分钟，比30分钟好，你也可以自己做validation 自己摸条件
7、最后再用1xPerm Wash Buffer 2ml洗一次，倾倒后，加入适量FACS Buffer就可以过流式了。
我觉得关键步骤都在这里了，只是不知道你具体想做哪些抗体，也不知道你抗体的公司，如果有进一步的信息我们可以深入交流一下
