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标题:[求助]细胞复苏老是出问题？

阿敏[使用道具]
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发表于 2012-5-14 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞复苏老是出问题？




我的细胞冻存复苏老是出现问题，就是复苏后生长状态特别差，本来之前挺好的，所以严重怀疑是冻存复苏的问题，我是这样操作的：冻存：收细胞1000转离心3min，然后加入预先配的冻存液（DMSO：血清=1:9),转入冻存盒，放－80，第二天转入液氮，复苏是迅速放38度水浴锅钟，1min内融化，然后1000离心3min。这就是整个过程，请大家看看哪里有问题，细胞状态特别差。还有我复苏的时候离心也是1000min3min，但是发现不是所有的细胞都离下来，沉到瓶底，但是细胞数量不影响。
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阿敏[使用道具]
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发表于 2012-5-14 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

由于不敢用太大转数，怕损伤细胞，所以虽然没有完全离心下来，但是依然往下做了，倒掉液体加入新鲜培养基进行培养
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发表于 2012-5-14 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转入冻存盒——是不是梯度降温？如果不是，请使用程序降温盒，不然按照4C－－20C－－80C比较好
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阿敏[使用道具]
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发表于 2012-5-14 14:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

当然是梯度降温啊，我都不知道问题究竟出在哪里
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flower-201[使用道具]
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发表于 2012-5-14 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议考虑一下1.细胞冻存时的密度会不会太低;2.复苏的时候可以尝试,如果你培养的细胞对DMSO不是特别敏感,可以先不离心,直接将复苏细胞转入培养瓶,稍微多加点培养液,待细胞贴壁后换液
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发表于 2012-5-14 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是你本身的细胞就不是很好,但在冻存的时候细胞的密度大概在80%-90%左右,如果细胞太密对冻存的细胞不会很好
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2012-5-14 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从你说的操作步骤来看，细胞冻存和复苏都没有任何问题。我不清楚你冻存的是什么细胞，有些细胞是冻存后就很难复苏起来，如HUVEC（人气静脉内皮细胞），再有可能是你冻存前细胞的状态。
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发表于 2012-5-14 15:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

真如楼上所说，直接将复苏后的细胞连同冻存液一起加至培养基中，待细胞贴壁状态较好时再换液。
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greenbee[使用道具]
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发表于 2012-5-14 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

冻存和复苏好象没什么问题．我们还用过２０００转／分．也许和细胞种类有关．会不会是血清的问题？
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阿敏[使用道具]
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发表于 2012-5-14 15:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢大家了，我的是2BS胚肺二倍体成纤维细胞。
实验室都是用一种血清，别人都好像没有出现我这种问题。冻存前细胞密度大概是85%左右吧，状态很不错的
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