[求助]关于接种六孔板、提蛋白等等的一些疑惑！

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标题:[求助]关于接种六孔板、提蛋白等等的一些疑惑！

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2012-5-15 10:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位群友：
最近测酶活性，但觉问题一大堆！
1、接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？
2、给细胞染毒时我听说有两种方案，比如说染三天毒
一、先接种20%-30%，三天之后收获时刚好长满
二、一开始就接种70%-80%，然后以3%或者5%血清，这样尽量不让细胞分裂增值，三天之后收获
试问，哪个更可行呢？
3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子，哪个更好些？可否提供两种方案的具体步骤？
4、裂解后一定会出现粘稠物质吗？

铜雀[使用道具]
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发表于 2012-5-15 11:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？
首先接种量要一致，然后加到板子中后用十字交叉法晃动平板摇匀，再生长12-24h，让都长到89-90%左右，一般问题不大
2、给细胞染毒时我听说有两种方案，比如说染三天毒
一、先接种20%-30%，三天之后收获时刚好长满
二、一开始就接种70%-80%，然后以3%或者5%血清，这样尽量不让细胞分裂增值，三天之后收获
试问，哪个更可行呢？这个不懂，但是个人认为如果确定不了，可先做次预实验比较一下，当然可能病毒不那么方便，看情况吧
3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子，哪个更好些？可否提供两种方案的具体步骤？
各有利弊：
消化下来再裂解，有可能有酶的污染，使蛋白不稳定，但是可以将蛋白浓度弄得比较大；直接加进板子里裂解不会有外源污染，但是蛋白浓度会比较固定，如果目的蛋白量很低就不适合了。至于具体步骤，要根据楼主所用的试剂不同不太一样，最好使用公司试剂盒，根据说明书来（省心。。。不过费钱。。。）
4、裂解后一定会出现粘稠物质吗？
是指基因组吗？有许多方法可以去除的，比如加入DNase或者超声等等

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2012-5-15 11:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先接种量要一致，然后加到板子中后用十字交叉法晃动平板摇匀，
3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子，哪个更好些？可否提供两种方案的具体步骤？
各有利弊：
至于具体步骤，要根据楼主所用的试剂不同不太一样，最好使用公司试剂盒，根据说明书来（省心。。。不过费钱。。。）

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请问群友什么叫做十字交叉法呢？如果要摇匀，接种后我把培养板放到摇床去摇可以吗？
还有试剂盒，群友你用过吗？它们叫什么名字？目的都是什么？
烦请多多指点。谢谢你！

铜雀[使用道具]
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发表于 2012-5-15 11:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

十字交叉就是将板子贴着桌子，先前后晃再左右，以十字的形式晃动，将细胞晃匀，防止成簇。摇床力量太大了，容易染菌，不推荐

试剂盒我用过RIPA裂解液，那个公司的忘了，主要是裂解液，自己再加点PMSF就行了

greenbee[使用道具]
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发表于 2012-5-15 11:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问战友什么叫做十字交叉法呢？如果要摇匀，接种后我把培养板放到摇床去摇可以吗？
还有试剂盒，战友你用过吗？它们叫什么名字？目的都是什么？
烦请多多指点。谢谢你！

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1。十字交叉，就是6孔板贴着桌面，前后左右晃晃，目的是使细胞分布均匀，摇床。。。这个。。。没必要，细胞要贴壁生长，一直晃怎么行。。。

2。我们用的盒子是Pierce的，提蛋白测浓度的，具体货号忘记了，网上搜下应该很好找，目的嘛，当然是提取细胞总蛋白测浓度了；

3。我们都是直接把裂解液加到板子里，避免先用胰酶消化引入蛋白酶，使蛋白降解。。。

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2012-5-15 11:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢各位！
受益颇多！
还有一问：裂解液似乎有很多配制方案，就提取总蛋白来讲会有不同效果吗？

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2012-5-15 11:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

RIPA裂解缓冲液常用配方：(Tris-HCl, 50 mmol/L, pH 7.5；NaCl, 150 mmol/L；NP-40, 1%；脱氧胆酸钠, 0.5%；SDS, 0.1%；EDTA, 1 mmol/L；PMSF, 1 mmol/L；Leupeptin, 2 μg/ml)

只使用过这一种裂解液，效果不错，其他没使过，不好说效果有没不同，感觉成分应该差不多，可能就差在用的是不同的蛋白酶抑制剂吧。

一叶[使用道具]
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发表于 2012-5-15 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？

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可以试试先在离心管里配好需要的细胞浓度，再加到孔里，这样稍微晃一晃就行了，但切记不可旋转
但其实如果十字法用的多了，也很方便

用摇床的方法实在让人那个汗 = =！！！

一叶[使用道具]
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小中大

提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子，哪个更好些？可否提供两种方案的具体步骤？

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我用的是三去污裂解液，今天细看后才发现跟RIPA配方差不多。。。
三去污裂解液：
Tris-Cl(pH=8.0) 50mM
NaCl 150mM
NaN3 0.02%
SDS 0.1%
NP-40 1%
脱氧胆酸钠 0.5%
EDTA 1mM

具体方法：将35mm培养皿贴壁超过90%以上，状态良好的细胞置于冰上，弃去细胞培养基，用冰预冷的PBS洗两次，将残留的PBS尽量吸干，再加入30-40μL三去污细胞裂解液（含1mM PMSF），冰上放置30min，用枪头将细胞刮下，收集到1.5mlEP管中，4°C最高转速离心25min，收集上清，存放于-30°C。

关于加不加蛋白酶抑制剂的问题，我觉得跟你研究的蛋白是否容易降解有关。
其实裂解液里已有不少抑制蛋白酶活性物质存在。
象我正在研究的蛋白，并不需要加PMSF或什么蛋白酶抑制剂cocktail，也能顺利的完成实验。

一叶[使用道具]
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小中大

裂解后一定会出现粘稠物质吗？

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我的细胞每次都会，通常会以最大转速度离心20-25min，取上清保存起来。不过要看你收集什么蛋白了，离心后的上清是细胞浆蛋白，细胞膜蛋白都沉淀下来，所以如果是研究细胞膜蛋白就不用离心了。
还有如果你的蛋白容易降解的话，也不能离心太久。

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