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标题:[求助]细胞消化次日出现大量细胞碎片

克隆鱼[使用道具]
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发表于 2012-5-15 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞消化次日出现大量细胞碎片



我现在每次消化细胞，第二天培养瓶中都会观察到大量细胞碎片，而且细胞状态不佳。
我养的细胞容易成团生长，培养瓶中多数细胞不易消化，所以我会稍微延长消化时间（所用消化液是胰酶+EDTA），吸取弃去消化液，加入新鲜培养液后，轻轻倾斜培养瓶，肉眼可见瓶底大片白色“细胞团块”滑落下来，我想问下诸位高手：这种情况属于消化过度吗？
镜下观察，细胞成团漂浮，甚至有十多个或几十个细胞聚集在一起，于是进行吹打处理，再次观察，成团的情况稍有改善。
吹打对细胞也有损伤吧?我进行操作时尽量轻柔了，会不会是吹打使细胞破碎形成大量的细胞碎片？
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2012-5-15 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

消化后即刻镜下观察并未发现较多的细胞碎片，培养液液中大量漂浮着成团的细胞。
是否成团细胞贴壁不良，导致细胞死亡，但是死亡的细胞裂解的速度会不会太快了？
希望各位高手不吝赐教哦，在此先谢谢大家的关注！感激不尽 ！
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2012-5-15 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我消化贴壁细胞时先用PBS漂洗一下，把培养基里残留的血清冲掉~~！！
然后加入已经预热的胰酶，待细胞成片块装脱落下来就及时用含血清的培养基终止~！
这时如果在显微镜下观察可以看到细胞很多都是聚集在一起的，我喜欢把消化的细胞再转移到试管中，离心后弃上清，加入新鲜的培养基，用吸管轻柔吹打成单细胞，然后再加入到新的培养瓶中饥渴~~！！
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发表于 2012-5-15 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我和楼上的方法相似，感觉这样子比较能减少胰酶的影响。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2012-5-15 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最好说明你的细胞类型更好判断.

"肉眼可见瓶底大片白色“细胞团块”滑落下来"--说明消化已经过度;

而你的"培养液液中大量漂浮着成团的细胞"

两者综合看,应该是吹打不够导致的;

消化和机械吹打结合个人认为对细胞的损伤较小;希望有用对你.
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2012-5-15 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上诸位高手的指教和建议！

我培养的细胞是MIN6细胞，生长过程中容易成团生长，甚至“覆盖”生长。消化时有些细胞濒临消化过度，有些细胞团还没有明显改变。

曾尝试过消化+吹打，一旦观察有部分细胞变圆就终止消化，然后没有消化下来的细胞团通过吹打使之脱落，可是效果不佳，多数细胞团都吹不下来。

也尝试过分批消化，部分细胞变圆后终止消化，吹打，然后转种于另一个培养瓶。将原瓶剩余细胞用D-Hanks液冲洗，再次加入消化液（胰酶+ EDTA），再次消化。可是最后发现对细胞损伤也很大。

消化终止后进行离心，然后加入培养液重悬细胞——也尝试过。不过猜测是消化液+机械吹打+离心多种因素作用于细胞，对细胞影响大，后来观察细胞碎片多，而且贴壁后的细胞状态变差，细胞有些皱缩，并且有些还出现拉丝状的伪足。
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2012-5-15 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为细胞量不多，而且细胞生长缓慢，所以每次消化损失一部分细胞让我很心痛。由于细胞还没有大规模培养起来，所以后续的实验还不能进行。

我会延长吹打时间，试试看，不过有些顾虑，担心长时间吹打对细胞不利。
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克隆鱼[使用道具]
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发表于 2012-5-15 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞传代次数多了是否会表现出‘老化’征象，从而影响消化？
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发表于 2012-5-15 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养的细胞MARC145,是细胞里外都有黑点，形态不好、不匀称，边界不清晰、不亮，折光不好，灰灰的，但细胞基本贴壁、很少漂浮,原来应该是铺路石样的现在就象是烧饼,长的慢,但是培养液清澈,而且没黄,应该没被污染吧?那是什么原因呢?希望个位大虾指教下
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发表于 2012-5-15 12:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人建议：
加入消化液后在镜下观察，细胞皱缩，细胞间空隙增大后，倾去消化液，加入适量培养液终止消化，最佳状态应为，倾不去细胞，沿壁加入培养液，可明显看见细胞被冲下，为消化最佳状态。
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