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标题:[求助]细胞转染，挑单克隆

xyw5[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]细胞转染，挑单克隆




最近准备做转染，开始是用六孔板做的，但是转染的效率有点高，结果单克隆靠的太近，现在用10cm的培养皿做，以6孔板的细胞来稀释10倍，在接到10cm的板子里去，我算了算大概也就2乘10的4次方个细胞，这么少的细胞在培养皿里 是 不是 又 点少。又 没 又用大皿做过的人，能给偶些经验

偶 还想问问，那 个 单克隆该 咋挑，上会做了一回，太辛苦了，谁有好的方法啊

谢谢了
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summerxx[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知你的细胞是否耐受基地密度培养、
10倍稀释是可以的，还可以在稀释一下；等到一定的汇合率的时候，加入筛选培养基来筛选，一段时间后，形成克隆，可以把克隆取出，在扩大培养。
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们一般用克隆环挑取单克隆：先在显微镜下划下单克隆所在位置，再倒掉旧培养基，PBS洗两遍，将先前划好的克隆用克隆环圈起，加胰酶消化，培养基终止，最后吸取细胞悬液入96孔板进行培养。
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xyw5[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，我前段时间试过一回，感觉在显微镜下划点相当的费劲。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

直接拿高压的牙签挑,我不明白为什么要稀释呢?直接减低使用的质粒的浓度就可以了啊,这样长的克隆少,可以通过铺饲养细胞促进生长,然后再筛
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不知道你们是怎么做的 。我们挑单克是进行多次有限稀释，直到 每个孔 一个克隆为止，这样直接消化或吹下来，按 一定的密度转接到6孔板中，等 6孔板 长满后在转到细胞瓶里。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的那个细胞密度肯定是太稀了，因为细胞具有群居生长的特性，如果细胞太少，肯定涨的慢 ，或是不长。一般接种密度为10的5次方或6次方。你也可以查一下资料
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xyw5[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是准备用6孔板做转染，稀释后再用10cm的筛选，因为开始的预实验发现转染效率比较高，细胞靠的近，无法挑出来，用6孔的细胞稀释后在放到10 cm的板子里，我怕长不起来。

我 还 想问问楼上，你们是这么把细胞稀释到 每孔只有一个单克隆的，能具体告诉下 偶 么 ，偶 想学学。
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-5-15 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就是无限稀释,稀释成一个孔一个细胞的浓度,比如96孔板,每孔加0.2毫升,你就稀释成5个每毫升,然后加到96孔板里,加完后在镜下看哪个孔只有一个细胞,做好标记,等长满的时候就传到大一点的板子里,扩大培养.
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xyw5[使用道具]
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 小中大
我用6孔板转完后，用6孔板的细胞来稀释，稀释成5个/毫升，在加96孔板，是这样做筛选么？
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