[求助]sf9细胞转染是否成功？

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标题:[求助]sf9细胞转染是否成功？

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的问题是因为前段时间细胞状态特别不好，经调整培养条件后，状态好转了。然后做了转染，请问，通过以下图片是否可以判断转染成功，并请高人帮我指出典型的病变细胞。感谢了。因为转染后细胞看起来比较像前些天状态不好的细胞，所以现在不敢轻易下结论了。

附件

2012-5-18 13:29

89100639.snap.jpg (34.02 KB)

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在上2张转染了的图片，恳请高人不吝赐教！不甚感激！所有倍率都是40的物镜和10倍的目镜！

附件

2012-5-18 13:29

43460982.snap.jpg (39.67 KB)

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问是用什么转染的？

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #3 jrwyyplt 的帖子

merk 的，infection easy juice ，PCR检测了，阳性

zhenxin[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

merk 的，infection easy juice ，PCR检测了，阳性

————————————————————————

是用rt-pcr检测了mRNA是吗？
你有没有转染空载体的细胞的阴性对照？

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用的是转染细胞抽提的DNA做模板，分别采用目的基因特异引物和M13引物扩增，以未转染细胞DNA为对照模板，不知是否有不妥的地方，不吝指教！谢谢！

caihong[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的设计存在很大问题
1。你这么做只能确定你的质粒存在在此细胞或者细胞培养液中，pcr相当敏感，痕量的DNA都可能扩的出来。并不能证明质粒可以在sf9细胞中很好的表达，而且没有这么做的。
2。我认为你第一步应该做western，用来确定蛋白是否真正的在细胞中正确表达。
3。你需要转染空载体的阴性对照，与转染重组载体的细胞在各项指标上进行比较
4。多说一句，转染效率或者成功率不是用眼睛看出来的，除非你的质粒上带像GFP这种东西。更不能凭借转染后细胞状态变差来衡量，你需要检测相关的细胞病变指标，用实验数据来说话。

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

外源蛋白在细胞中表达的前提条件是成功转染。在不确定是否转染成功的时候盲目的做western感觉有点浪费，主要是我没有在目的基因上加标签啊，一抗比较贵哦，而且影响western的因素也非常多，western不成功也不一定说明转染失败或者表达失败吧。而且sf9转染bacmid是可以通过细胞病变判断的，抽提细胞内病毒粒子基因组DNA进行PCR基本可以判断重组Bacmid转染是成功的了。下一步就是看重组病毒中目的基因是否表达，我想先通过抽提RNA进行RT-PCR，先看目的基因在该系统中是否转录，如果能够成功转录，最后再做western，判断是佛偶翻译，不知道是否合理？

caihong[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

原来是穿梭载体和病毒重组。
1。下一步还是要先包装好病毒，放大之后，测病毒滴度和MOI，再感染细胞，检测蛋白表达。
2。这个系统应该自带阴性对照的Bacmid，为何不用？却一直用未转染的细胞作对照？
3。另外作反转录似乎可以先不做，就算你做了，最后还是要做western。如果western可以做出来，反转录则可以不做啊。
顺便问一句，你是用的蓝白筛选，之后挑菌作pcr得到的阳性重组bacmid是吗？
个人意见，仅供参考

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2012-5-18 13:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是的，我现在做病毒滴度扩增，大约F3后，测定滴度和MOI，达到要求就开始做表达。
该系统是学校其他单位所送，其中只给了一瓶细胞-sf9，一种质粒-pFastBac1，和一种菌DHBac10，好像是这个吧。您所说的阴性对照是指未发生转座的空Bacmid吗，我有抽提，但是我想，如果转染这个的话，是不是就产生了有多角体的病毒，那样只能做阳性对照了，而且发生病变的细胞与重组病毒有些不一样吧，重组的多角体蛋白被插入破坏，不会产生多角体吧，基于病变形态不一样，就没有用这个阳性对照了。您所指的阴性对照是什么，我还是没有弄的很明白，请再详细一些，好吗，谢谢了！
如果能一下子就做出westernblot，我也考虑不做RT-PCR了，毕竟抽提RNA，做RT也麻烦啊。所以还是按照tiger22的意见，先试一下westernblot。感谢您！
重组的bacmid 是通过蓝白斑筛选，再单克隆划线，随后用M13 引物PCR确认后的转座菌扩大培养，手工抽提获得的。不知道是否还需要做病毒筛斑纯化？
此外，从目前感染细胞扩大滴度的试验来看，细胞发病似乎越来越早了，F1是大约5-7天出现的症状，F2则是2-3天细胞就明显变圆，变大，并大量漂起，到F2感染细胞后，大约12个小时就看到细胞变圆了，变大了，24h就有很多漂起了，这应该属于正常的现象吧？

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